含銅不銹鋼冠脈支架材料對血管細胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 冠心病是一種最常見的心血管疾病，是由于心臟冠狀動脈管壁形成粥樣斑塊所造成的血管腔狹窄和供血不足的心臟病變。目前，治療血管狹窄與閉塞等疾病的方法多采用經皮冠狀動脈腔內血管成形術（Percutaneous transluminal coronaryangioplasty PTCA），即在冠狀動脈內球囊擴張術的基礎上在狹窄的部位植入支架，球囊擴張后，支架將病變部位血管擴張，增加了血流量以達到治療目的。然而，大約20％-3

2、0％接受過血管內支架置入術治療的病人會發(fā)生血管再狹窄的現象。其中，約有10％的病人需要再次植入支架，這給患者帶來了巨大的經濟以及心理上的負擔。為了減少二次血栓的形成，人們開展了新型心血管不銹鋼支架材料的基礎研究和醫(yī)用開發(fā)。銅是人體內一種必需微量元素，參與了生命活動的多個環(huán)節(jié)，具有重要的生物學作用。因此，人們試圖將銅作為一種元素摻入在心血管不銹鋼支架材料中，防止血管再狹窄。但是，含銅不銹鋼能否作為血管支架的材料，還需要在分子和細胞水平上進

3、行全面和認真的考證。本實驗利用分子生物學和細胞生物學技術研究了含銅不銹鋼冠脈支架材料對血管內皮細胞和平滑肌細胞的細胞生長、細胞增殖和細胞周期的影響。該實驗的結果和結論對為探究再狹窄機制，新型金屬支架材料的研發(fā)提供了實驗基礎和理論依據。
　　 實驗材料與方法:
　　 一、觀察細胞生長狀況
　　 將體外培養(yǎng)的大鼠平滑肌細胞制成細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，然后取出長有

4、細胞的金屬片，用姬姆薩染液進行細胞染色，置于金相顯微鏡下觀察血管內皮細胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細胞生長狀況。
　　 二、細胞生長活性的測定
　　 取對數生長期的血管內皮細胞，將細胞制成細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5和7天取樣，通過MTT法測定細胞的生長活性，用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定OD值，求出每一組的平均OD值。
　　 三、細胞生長

5、曲線的測定
　　 取對數生長期的血管內皮細胞，將細胞制成細胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各組均在開始培養(yǎng)后的7天內每天連續(xù)收集細胞，制成細胞懸液，并通過臺盼藍染色后在光學顯微鏡下進行細胞計數，并繪制細胞生長曲線。
　　 四、細胞周期分析
　　 取對數生長期的血管內皮細胞，制成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組細胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血

6、清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，再更換為含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時間點分別取樣，并收集細胞置于離心管中，通過流式細胞儀進行細胞周期分析。
　　 五、細胞凋亡檢測
　　 取處于對數生長期的血管內皮細胞，制成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細胞置于離心管中通過流式細胞儀對細胞凋亡進行檢測。
　　 六、實時定量PCR檢測

7、>　　 取處于對數生長期的血管內皮細胞，制成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細胞置于1.5 mL離心管中。然后提取RNA，測定各組RNA純度和濃度。反轉錄得到DNA模板，按照Takara說明書的要求進行Real-Time PCR的檢測。以基因GAPDH作為內參，定量分析316L和316L-Cu兩種不銹鋼金屬支架材料對血管內皮細胞基因水平表達的影響。
　　

8、結果:
　　 1、通過顯微鏡對大鼠平滑肌細胞細胞形態(tài)和細胞數目的觀察、MTT實驗對血管內皮細胞細胞增殖活性的檢測和流式細胞儀對血管內皮細胞細胞周期的檢測可以看出，在316L-Cu不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內皮細胞其細胞生長水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內皮細胞。
　　 2、通過流式細胞儀對細胞凋亡的檢測，可以看出培養(yǎng)在316L-Cu不銹鋼金屬材料上的血管內皮細胞在培養(yǎng)7天后其細胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在316