冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠模型作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1目的：
　　 本課題以卵蛋白(OVA)致敏和攻擊復(fù)制豚鼠哮喘模型，探討冷哮丸對(duì)豚鼠哮喘模型在乙酰膽堿(Ach)激發(fā)后所致呼氣阻力和氣管螺旋條對(duì)組織胺反應(yīng)性的影響；外周血和肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)量、肺組織形態(tài)學(xué)觀察；以及對(duì)血清免疫球蛋白E(IgE)，血清和BALF中IL-4、IL-5、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)等指標(biāo)的影響，從免疫反應(yīng)、氣道炎癥反應(yīng)、氣道重塑和氣道反應(yīng)性等方面探討該方的平喘

2、作用機(jī)制。
　　 2方法：
　　 2.1材料
　　 2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)豚鼠60只，雄性，體重250±50g，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。
　　 2.1.2藥劑制備：冷哮丸由麻黃、生川烏、細(xì)辛、蜀椒、白礬、牙皂、半夏曲、陳膽星、杏仁、甘草、紫菀、款冬花共12味中藥組成，按1:1：1:1:1:1:1:1:1:1:2:2比例，加10倍量的水煎煮2h，醫(yī)

3、用紗布過(guò)濾，濾渣加入6倍量的水煎煮1h，過(guò)濾，兩次濾液合并，低溫放置24h，過(guò)濾并水浴濃縮至原生藥含量1.6g/ml，置低溫冰箱中(4℃)備用。由湖北中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂制劑室制備。地塞米松片，0.75mg/片。臨用時(shí)以蒸餾水稀釋至相應(yīng)藥物濃度灌胃。劑量：地塞米松1mg/kg；中藥冷哮丸小劑量組4mg/kg；中藥冷哮丸中劑量組8mg/kg；中藥冷哮丸大劑量組16mg/kg。
　　 2.1.3主要試劑：卵白蛋白(OVA)，Sigma公

4、司；乙酰膽堿，上?？曝S化學(xué)試劑責(zé)任公司；磷酸組胺，上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司；IgE放免試劑盒，北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；NO測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；豚鼠IL-4試劑盒，豚鼠IL-5試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司；ET-1放免試劑盒，北京東亞放射免疫所。
　　 2.1.4主要儀器：JSC-OK雙頭式多功能型超聲波霧化器；RJE壓力換能器；LMS-2B型二道生理記錄儀；DH-140型動(dòng)物人工呼吸機(jī)；ThermoLabsy

5、stemsMultiskan MK3酶標(biāo)分析儀；722型光柵分光光度計(jì)；Olympus BX50F-3雙顯微鏡(含自動(dòng)照相裝置Nikon E990)；VEX380型-80℃低溫冰箱。
　　 2.2方法
　　 2.2.1動(dòng)物模型復(fù)制
　　 以卵蛋白致敏和攻擊復(fù)制豚鼠哮喘模型。實(shí)驗(yàn)第1天，配制100g/L卵蛋白生理鹽水，豚鼠腹腔注射1ml卵蛋白生理鹽水以致敏；第15天將致敏豚鼠置于15升透明玻璃罩內(nèi)，給予1％卵蛋白生

6、理鹽水霧化吸入。以后每隔24h以1％卵蛋白生理鹽水誘喘，共4次。正常對(duì)照組用同樣方法以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。
　　 2.2.2動(dòng)物分組
　　 將豚鼠隨機(jī)分為6組：①正常對(duì)照組，②哮喘模型組，③西藥對(duì)照組(地塞米松治療組)，④冷哮丸大劑量組，⑤冷哮丸中劑量組，⑥冷哮丸小劑量組，每組10只。
　　 2.2.3實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目
　　 2.2.3.1實(shí)驗(yàn)一冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠氣道反應(yīng)性的影響。①一般情況觀察

7、：包括各組豚鼠的行為、飲食、體重、排便、皮毛及死亡等情況。②乙酰膽堿(Ach)支氣管激發(fā)試驗(yàn)：于第23 d治療結(jié)束后2h，用3％戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，仰面固定于木板上，切開(kāi)頸部皮膚暴露頸靜脈及氣管，用靜脈留置針行頸外靜脈穿刺置管，行氣管切開(kāi)、氣管插管，連DH-140型動(dòng)物人工呼吸機(jī)行輔助通氣。每只豚鼠分別給予成倍增加的乙酰膽堿(0、12.5、25、50、100、200μ g/kg)，每次進(jìn)液量200μl，兩個(gè)相鄰給藥點(diǎn)

8、間隔5min。采用AniRes2003動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)連續(xù)動(dòng)態(tài)測(cè)定呼氣阻力(expiratory resistance，Re)，計(jì)算各給藥時(shí)間點(diǎn)的Re與基礎(chǔ)的Re比值(以百分?jǐn)?shù)表示)，以Re的變化代表氣道反應(yīng)性。③組織胺氣道反應(yīng)性測(cè)定：豚鼠麻醉后，縱向剪開(kāi)頸部皮膚及皮下組織，暴露氣管，取中段氣管軟骨環(huán)，剪開(kāi)形成3 mm寬的氣管螺旋條。用細(xì)線將螺旋條一端固定于浴槽底部，另一端連與壓力換能器。對(duì)螺旋條施以2 g的起始張力，平衡1 h后，間

9、隔2-3min依次加入10-6-10-3mol/L的組織胺進(jìn)行刺激，連續(xù)記錄氣管螺旋條的張力變化。
　　 2.2.3.2實(shí)驗(yàn)二冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS數(shù)量及肺組織形態(tài)學(xué)的影響。于第23d麻醉動(dòng)物，分離頸動(dòng)脈，取頸動(dòng)脈血1ml作白細(xì)胞分類(lèi)和EOS計(jì)數(shù)。其余全血離心，取血清，放置-20℃低溫冰箱中保存待檢。對(duì)采血后的豚鼠進(jìn)行肺泡灌洗，并回收肺泡灌洗液(BALF)，瑞氏染色后行EOS計(jì)數(shù)，肉眼及光鏡觀察豚鼠肺組織形態(tài)學(xué)

10、變化。
　　 2.2.3.3實(shí)驗(yàn)三、四、五冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清總IgE、血清和BALF中NO、IL-4、IL-5、ET-1的影響。按豚鼠IgE、NO、IL-4、IL-5、ET-1等相關(guān)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作測(cè)定。
　　 2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3結(jié)果：
　　 3.1實(shí)驗(yàn)一：冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠氣

11、道反應(yīng)性的影響
　　 3.1.1一般情況結(jié)果：正常對(duì)照組豚鼠無(wú)任何不適反應(yīng)，平均體重增加，毛色光澤。哮喘模型組豚鼠普遍精神較差，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食及飲水量明顯下降，毛色失去光澤，出現(xiàn)不同程度的呼吸次數(shù)增加，張口等呼吸困難癥狀，在整個(gè)喂養(yǎng)過(guò)程中體重增加不明顯。哮喘模型組1只豚鼠哮喘嚴(yán)重發(fā)作經(jīng)搶救無(wú)效死亡。各用藥組豚鼠情況均較哮喘模型組明顯改善。
　　 3.1.2各組豚鼠在不同濃度Ach激發(fā)后Re增長(zhǎng)率比較：在Ach濃

12、度為50μ g/kg、100μg/kg、200μg/kg時(shí)，哮喘模型組Re的增長(zhǎng)率與正常對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在Ach濃度為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg時(shí)，地塞米松治療組、冷哮丸大、中、小劑量組與哮喘模型組Re的增長(zhǎng)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。地塞米松治療組與冷哮丸大劑量組之間，及其與正常對(duì)照組之間Re的增長(zhǎng)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

13、　　 3.1.3各組豚鼠氣管螺旋條對(duì)組織胺的反應(yīng)性比較：當(dāng)浴槽中組織胺濃度達(dá)到10-5-10-3mol/L時(shí)，各組豚鼠氣管螺旋條產(chǎn)生劑量依賴性收縮。哮喘模型組豚鼠氣管螺旋條張力明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。地塞米松治療組和冷哮丸大、中、小劑量組哮喘豚鼠的氣管螺旋條對(duì)組織胺的反應(yīng)性均降低，各個(gè)濃度組織胺所誘導(dǎo)的氣管螺旋條收縮張力與正常組類(lèi)似(P>0.05)。
　　 3.2實(shí)驗(yàn)二冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS數(shù)量及

14、肺組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 3.2.1冷哮丸對(duì)豚鼠血及BALF中EOS計(jì)數(shù)的影響
　　 各組豚鼠血及BALF中EOS計(jì)數(shù)結(jié)果表明：正常對(duì)照組豚鼠血及BALF中白細(xì)包總數(shù)(white blood-cell count，WBC)、EOS絕對(duì)值及百分比均較低，模型組豚鼠血及BALF中WBC、EOS絕對(duì)值及百分比顯著增加，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，哮喘可引起實(shí)驗(yàn)豚鼠外周血及BALF中炎性細(xì)胞總數(shù)

15、，尤其是EOS增多，這是氣道炎癥反應(yīng)的病理學(xué)基礎(chǔ)。治療組各組動(dòng)物外周血和BALF中自細(xì)胞總數(shù)、EOS數(shù)與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中地塞米松組和冷哮丸大劑量組EOS數(shù)與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而冷哮丸中、小劑量組EOS數(shù)與正常對(duì)照組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明冷哮丸能較好地控制哮喘的氣道炎癥性反應(yīng)，而且存在劑量依賴關(guān)系。
　　 3.2.2肺組織肉眼觀察<

16、br>　　 正常對(duì)照組：肺組織呈淡紅色，表面光滑，組織柔軟富有彈性。哮喘模型組：肺組織呈暗紅色，表面呈顆粒狀，組織膨脹明顯，部分組織顏色加深。藥物治療各組肺組織介于前二者之間。
　　 3.2.3肺組織HE染色光鏡觀察
　　 正常對(duì)照組：豚鼠肺組織支氣管黏膜上皮排列整齊，黏膜下層及外膜層次清楚，無(wú)炎癥反應(yīng)，管腔清潔完整無(wú)分泌物。哮喘模型組：支氣管黏膜上皮可見(jiàn)局灶性脫落，黏膜下層明顯充血水腫，EOS灶狀浸潤(rùn)，內(nèi)夾少許淋巴細(xì)

17、胞、漿細(xì)胞。高倍鏡下見(jiàn)黏膜杯狀細(xì)胞增生，數(shù)量增多，平滑肌增生肥大。黏膜下層炎癥細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)。地塞米松組：支氣管管壁結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮部分恢復(fù)正常，黏膜下層輕度充血水腫，管腔未見(jiàn)分泌物。冷哮丸大劑量組：支氣管管壁結(jié)構(gòu)基本完整，黏膜上皮部分恢復(fù)正常，黏膜下層水腫明顯減輕，支氣管管腔恢復(fù)正常，未見(jiàn)炎性滲出物。冷哮丸中劑量組：管腔內(nèi)見(jiàn)少許脫落的上皮細(xì)胞，粘膜增生，基層輕度肥厚。黏膜下層見(jiàn)輕度充血水腫及少量炎癥細(xì)胞，管腔內(nèi)仍見(jiàn)炎性滲出物。冷哮丸小

18、劑量組：支氣管管壁結(jié)構(gòu)層次清楚，黏膜上皮逐漸恢復(fù)，管腔內(nèi)可見(jiàn)部分炎性滲出物。
　　 3.3實(shí)驗(yàn)三冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清總IgE、血清和BALF中NO的影響
　　 3.3.1冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清IgE含量的影響
　　 與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組豚鼠血清總IgE含量升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組血清總IgE含量較模型組均明顯降低(P<0.01)，各治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。<

19、br>　　 3.3.2冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和BALF中NO含量的影響
　　 哮喘模型組血清和BALF中NO含量明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給予地塞米松或不同劑量冷哮丸經(jīng)治療后，血清和BALF中NO含量均明顯降低，與哮喘模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。但治療后，冷哮丸中、小劑量組血清和BALF中NO含量與正常對(duì)照組相比，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

20、>　　 3.4實(shí)驗(yàn)四冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和BALF中IL-4、IL-5的影響
　　 3.4.1冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和BALF中IL-4含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血清和BALF中IL-4含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清血清和BALF中IL-4含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.4.2冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和B

21、ALF中IL-5含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血清和BALF中IL-5含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清和BALF中IL-5含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.5實(shí)驗(yàn)五冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和BALF中ET-1的影響
　　 3.5.1冷哮丸對(duì)哮喘豚鼠血清和BALF中ET-1含量的影響
　　 哮喘模型組豚鼠血

22、清和BALF中ET-1含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各治療組豚鼠血清和BALF中ET-1含量明顯下降，與哮喘模型組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各治療組間血清和BALF中ET-1含量比較，差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.5.2對(duì)氣道重塑的影響
　　 哮喘豚鼠支氣管黏膜上皮局灶性脫落，黏膜下層明顯充血水腫，EOS等炎癥細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)，黏膜杯狀細(xì)胞增生，

23、數(shù)量增多，平滑肌增生肥大，顯示哮喘模型組出現(xiàn)氣道重塑病理改變。經(jīng)冷哮丸治療后，豚鼠的氣道黏膜下層充血水腫，杯狀細(xì)胞增生、平滑肌增生肥大等氣道重塑病理也明顯改善。
　　 4結(jié)論：
　　 4.1以卵蛋白致敏加攻擊方法，可以誘發(fā)豚鼠氣道變態(tài)反應(yīng)，成功復(fù)制哮喘豚鼠模型。
　　 4.2實(shí)驗(yàn)證實(shí)哮喘發(fā)病與風(fēng)、寒、痰等密切相關(guān)。宿痰伏肺，遇寒觸發(fā)，致氣道攣急是哮喘發(fā)作的主要病機(jī)。
　　 4.3冷哮丸有溫肺散寒，滌痰化飲

24、，解痙平喘之功，對(duì)哮喘豚鼠有良好的治療效果，其作用機(jī)制是多途徑、多層次、多靶點(diǎn)綜合作用的結(jié)果。
　　 4.3.1冷哮丸能明顯抑制哮喘模型Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。作用機(jī)制與冷哮丸降低血清總IgE含量，下調(diào)IL-4、IL-5水平，抑制過(guò)敏介質(zhì)的釋放密切相關(guān)。
　　 4.3.2冷哮丸能有效控制哮喘豚鼠模型的氣道炎癥反應(yīng)，作用機(jī)制與冷哮丸降低血及BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量，減輕炎癥浸潤(rùn)，并降低血清和BALF中IL-4、IL-5、NO水平有關(guān)。