五味地龍湯對哮喘豚鼠作用機制的實驗研究.pdf

1、目的： 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種呼吸系統(tǒng)常見病，本課題以組胺激發(fā)以及卵蛋白(OVA)致敏和攻擊復制豚鼠哮喘模型，探討五味地龍湯對豚鼠哮喘模型在體、離體氣管平滑肌、肺泡灌洗液(BALF)中EOS數(shù)量、肺組織形態(tài)學，以及血清白三烯B<,4>(LTB<,4>)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)等的影響，從變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、氣道重塑等方面探討其止哮平喘的作用機制，為臨床開發(fā)有效的哮喘治療藥物提供依據(jù)。

2、材料與方法: 1.材料 1.1 動物：取體重200-300 g豚鼠，♀♂各半，華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：syxk(鄂)2004-0028。 1.2 藥物制備： 五味地龍湯組成：炙麻黃5g、地龍5g、魚腥草10g、柴胡10g、葶藶子10g、射干10g、五味子10g、細辛5g、蜂房5g、甘草10g。 小青龍湯組成：麻黃6g、白芍6g、細辛6g、干姜6g、炙甘草6g、桂枝

3、6g、半夏6g、五味子6g。 將上兩方加水煎煮三次合并后過濾，濾液水浴濃縮至五味地龍湯原生藥含量為2.88g·ml<'-1>，小青龍湯原生藥含量0.86g·ml<'-1>，低溫(4℃)放置備用。臨用時用蒸餾水稀釋，五味地龍湯大劑量組 2.88g·ml<'-1>，五味地龍湯中劑量組1.44g·ml<'-1>，五味地龍湯低劑量組0.72g·ml<'-1>。 1.3 主要試劑：磷酸組胺；卵白蛋白，Sigma 公司(USA)；氫

4、氧化鋁；豚鼠LTB<,4>試劑盒，RapidBio Lab.California(USA)；豚鼠IFN-γ試劑盒，RapidBio Lab.California (USA)；豚鼠 IL-4 試劑盒，RapidBio Lab. California (USA)。 2.方法 2.1 動物模型復制 2.1.1 磷酸組胺激發(fā)致喘法：用于實驗一觀察五味地龍湯對豚鼠吸入組胺致喘的影響。 2.1.2 卵蛋白(OVA)致

5、敏法：給豚鼠一次性腹腔注射10％OVA (含10％氫氧化鋁)生理鹽水1.0ml 致敏，并于第15d用1％OVA生理鹽水噴霧吸入致喘，每次噴霧時間為30s，以后每隔1d噴霧一次，連續(xù)8d。用于實驗二至實驗六。 2.2 動物分組及指標檢測 2.2.1 實驗一，五味地龍湯對豚鼠吸入組胺致喘的影響。取豚鼠 40只，隨機分為5組，抗原對照組、五味地龍湯大劑量組、五味地龍湯中劑量組、五味地龍湯小劑量組、氨茶堿組，每組8只。其中藥物處

6、理各組分別ip相應(yīng)藥物均為3ml。氨茶堿組ip氨茶堿125mg·kg<'-1>，抗原對照組ip相同量的生理鹽水。30 min后，各組分別測定其引喘潛伏期及6 min內(nèi)跌倒的只數(shù)。 2.2.2 實驗二，觀察五味地龍湯對致敏豚鼠離體氣管平滑肌過敏性收縮的影響。取豚鼠 40 只，動物分組同實驗一。用卵蛋白致敏法造模。于造模后第 23d 麻醉動物，放血處死，取出氣管段，按離體氣管裝置進行描記。記錄各組動物抗原攻擊后離體氣管條收縮曲線高度

7、的差值。 2.2.3 實驗三，觀察五味地龍湯對哮喘豚鼠BALF中EOS和肺支氣管組織形態(tài)學的影響。取豚鼠48只，隨機分為6組：正常對照組，哮喘模型組，地塞米松(陽性藥物)組，小青龍湯組，五味地龍湯大劑量組，五味地龍湯小劑量組，每組8只。哮喘豚鼠模型復制同實驗二。噴霧引喘當天開始，各引喘豚鼠分組ig給予相應(yīng)藥物3ml治療，每日一次，連續(xù)8 d。其中哮喘模型組只致敏不給藥，正常對照組用等量的生理鹽水處理動物。于第23 d麻醉動物，分

8、離頸動脈，取頸動脈血靜置2 h以上，以3000 r·min<'-1>離心 10 min，取血清，放置低溫冰箱中備用。實驗過程中觀察豚鼠一般情況，將麻醉取血后的動物進行肺泡灌洗(BAL)，回收BALF，染色后進行EOS計數(shù)，并用肉眼和光鏡觀察肺、支氣管組織形態(tài)學變化。 2.2.4 實驗四、五、六，分別觀察五味地龍湯對哮喘豚鼠血清LTB<,4>、IFN-γ、IL-4的影Ⅱ向。實驗動物分組、造模、處理同實驗三。按LTB<,4>、IFN

9、-γ、IL-4等相關(guān)試劑盒說明進行操作檢測上述血清指標。 2.3 統(tǒng)計學方法 各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，組間均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)論： 1.以卵蛋白致敏和攻擊，誘發(fā)豚鼠氣道變態(tài)反應(yīng)，可以成功復制豚鼠哮喘模型。 2.哮喘發(fā)病與風、痰等因素密切相關(guān)。外風傷肺，內(nèi)風擾肺，外風引動內(nèi)風、痰濁，是哮病發(fā)作的根本原因。風盛痰阻、氣道

10、攣急是哮喘急性發(fā)作的主要病機，風、痰、氣、瘀、虛、肝肺功能失調(diào)是哮喘發(fā)作期的基本病機特點。治療當以祛風止哮，降氣化痰與調(diào)理臟腑并重。 3.五味地龍湯有祛風止哮、化痰平喘作用，用于治療哮喘療效確切。 4.五味地龍湯治療哮喘的作用機制。 4.1 對氣道變態(tài)反應(yīng)的影響。不同劑量的五味地龍湯能對致敏豚鼠在體、離體氣管平滑肌過敏性收縮有顯著的抑制作用，并能使豚鼠哮喘潛伏期延長。還能明顯升高哮喘動物血清IFN-γ的水平，明顯

11、降低哮喘動物血清IL-4的水平。提示五味地龍湯可能通過升高哮喘豚鼠血清IFN-γ的水平、降低血清IL-4的水平等，調(diào)節(jié)輔助性T細胞相關(guān)細胞因子的比例，進而調(diào)節(jié)免疫平衡，抑制IgE合成，發(fā)揮解痙平喘作用。 4.2 對氣道炎癥的影響。五味地龍湯能減輕哮喘豚鼠氣道EOS浸潤，減少炎性介質(zhì)LTB<,4>的釋放，降低血清中IL-4水平、升高血清中 IFN-γ的水平，間接調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡等，改善氣道高反應(yīng)性。其在抗氣道炎癥作用方面

12、部分相當或接近地塞米松的治療作用，提示其解痙平喘作用途徑在改善氣道高反應(yīng)性方面具有優(yōu)勢。 4.3 對氣道重塑的影響。肺組織形態(tài)學觀察結(jié)果顯示，模型對照組支氣管粘膜上皮局灶性脫落，黏膜下層充血水腫，嗜酸性粒細胞灶狀浸潤，黏膜下平滑肌顯著增生肥厚。與正常對照組相比，模型對照組出現(xiàn)氣道重塑病理。經(jīng)五味地龍湯治療，氣管管壁結(jié)構(gòu)逐漸恢復，炎癥減輕，水腫明顯消失，增生肥大的平滑肌上皮細胞基本或逐漸恢復正常。提示五味地龍湯具有抑制哮喘豚鼠氣道