PM10及其代表性多環(huán)芳烴誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及其分子機(jī)制.pdf

1、據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界環(huán)境空氣污染每年造成約370萬人過早死亡，而88％發(fā)生在中等收入和低收入國家，導(dǎo)致這種現(xiàn)狀的主要原因是人群暴露于直徑為10微米或更小的顆粒物質(zhì)（PM10）中。顆粒物的化學(xué)成分會隨著地理位置、季節(jié)變化、產(chǎn)生來源的變化而改變，從而使其產(chǎn)生的毒性效應(yīng)大不相同。已有的流行病學(xué)結(jié)果表明，顆粒物污染會對人群心肺系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響，也會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、住院和死亡率增高。已有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，人群

2、生活環(huán)境中顆粒物污染嚴(yán)重程度與罹患中風(fēng)（Stroke）和阿爾茲海默病（Alzheimer's disease）的幾率成正比。在統(tǒng)計(jì)室內(nèi)、外空氣污染造成的死亡數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，腦卒中分別達(dá)到總死亡率的34%和40%。而且污染地區(qū)人群肺組織和腦組織中炎癥因子表達(dá)過高，易于促進(jìn)神經(jīng)退行性病變。因此，長期生活在大氣顆粒物污染的地區(qū)或者典型性沙塵暴等突發(fā)急性污染事件所引發(fā)的健康問題顯得尤為重要。由此，提出本課題的研究，探討大氣PM10污染及其代表性多環(huán)

3、芳烴對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷效應(yīng)。
　　1.在本課題中，我們首先將采暖期的PM10制備成不同濃度（最終染毒濃度為：0.3、1、3和10mg/kg（體重））的懸液，對清潔級雄性Wistar大鼠進(jìn)行氣管注入染毒處理，研究PM10對大鼠腦組織神經(jīng)元的損傷效應(yīng)。借助蘇木精-伊紅（htoxylin eosin，HE）染色和末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end

4、 labeling，TUNEL）染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化；采用酶聯(lián)免疫技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定細(xì)胞因子的表達(dá)；利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）技術(shù)分別測定大鼠大腦皮層內(nèi)皮、炎癥、凋亡和突觸可塑性相關(guān)因子在mRNA和蛋白水

5、平的改變；并通過透射電子顯微鏡（ transmission electron microscopy，TEM）觀察突觸超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，在經(jīng)過15天的PM10暴露后（每3天1次，共5次），大鼠大腦皮層有輕微的病理學(xué)異常發(fā)生；同時(shí)伴隨著內(nèi)皮素（endothelin-1，ET-1）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）之間的平衡被打破；促炎癥細(xì)胞因子白介素1β（interle

6、ukin1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）和黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）的表達(dá)顯著增加；PM10暴露上調(diào)bax/bcl-2比率和抑癌基因p53表達(dá)水平，誘導(dǎo)

7、神經(jīng)元凋亡。另外，PM10暴露還顯著刺激突觸可塑性相關(guān)指標(biāo)——突觸素（synaptophysin，SYP）、突觸后致密物（postsynaptic density protein95，PSD-95）、NMDA受體2B亞型（NMDA receptor subunit，NR2B）、磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)

8、合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，p-CREB）的表達(dá)。由此提示，PM10暴露能誘導(dǎo)大鼠腦損傷，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)，主要機(jī)制可能與內(nèi)皮功能障礙及炎癥反應(yīng)相關(guān)。
　　2.季節(jié)性的生產(chǎn)活動會導(dǎo)致PM10組成成分的不同，由此可能產(chǎn)生不同程度的健康影響。因此，在本研究中，我們將采集自不同季節(jié)（春、夏、秋、冬）的PM10樣品制備成顆粒物懸液，對原代培養(yǎng)皮層

9、神經(jīng)元、神經(jīng)元缺糖缺氧（oxygen glucose deprivation，OGD）模型和清潔級雄性Wistar大鼠（動物實(shí)驗(yàn)持續(xù)15天，每3天一次，共5次）進(jìn)行染毒，并驗(yàn)證大氣季節(jié)性PM10污染與類缺血性中風(fēng)損傷增加風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。我們借助TUNEL染色和免疫熒光染色（immunofluorescent staining，IF）觀察組織病理學(xué)變化；采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定細(xì)胞因子的表達(dá)；利用RT-PCR和Western blot技術(shù)分

10、別測定大腦皮層內(nèi)皮、炎癥、凋亡和突觸可塑性相關(guān)因子在mRNA和蛋白水平的改變；并通過TEM觀察突觸超微結(jié)構(gòu)變化；最后，對不同季節(jié) PM10樣品誘導(dǎo)的類缺血性損傷和理化特性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：不同季節(jié)PM10染毒可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元炎性標(biāo)記物（iNOS、COX-2和 ICAM-1）表達(dá)；增加磷酸化Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα（phosphorylated Ca2+/calmodulin dependent protein

11、 kinaseⅡα，p-CaMKⅡα）和p-CREB的蛋白水平；并誘發(fā)即早基因（immediately early gene，c-jun和c-fos）的高表達(dá)。同時(shí)，增加原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元OGD模型的易感性，并呈現(xiàn)明顯的季節(jié)效應(yīng)。另外，不同季節(jié)PM10樣品也能導(dǎo)致大鼠腦組織病理學(xué)損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡加劇，引發(fā)內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)，以及隨后的突觸損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)功能障礙。相關(guān)分析結(jié)果表明：以較高的多環(huán)芳烴（polycyclic aroma

12、tic hydrocarbons，PAHs）含量為特征的冬季PM10樣品，可以明顯的誘導(dǎo)類缺血性腦損傷，這意味著大氣PM10暴露可能是促成腦缺血性損傷發(fā)展和惡化的原因之一。
　　3.作為典型的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，苯并芘（Benzoapyrene，BaP）是一種廣泛分布的環(huán)境污染物。除了廣為人知的免疫毒性和致癌性，更多的數(shù)據(jù)證實(shí)BaP具有神經(jīng)毒性，尤其是對神經(jīng)行為學(xué)和認(rèn)知功能具有嚴(yán)重影響。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元和體內(nèi)

13、動物模型（動物實(shí)驗(yàn)持續(xù)7天，每天一次，共7次）來探討B(tài)aP及其代謝產(chǎn)物環(huán)氧苯并芘（Benzoapyrene diol epoxide，BPDE）誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。我們借助TUNEL染色觀察神經(jīng)元凋亡；利用熒光探針2，7-二氯乙酰乙酸鹽（2'7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）檢測法測定活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定前列腺素（PGs）和

14、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）表達(dá)；利用Western blot技術(shù)分別測定大腦皮層COX-1/COX-2、caspase-3和EP2/4受體蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BaP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性效應(yīng)可能是通過刺激COX-2及其代謝產(chǎn)物的表達(dá)增加來調(diào)控的。另外，BaP誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷效應(yīng)能被抗氧化劑、COX-2抑制劑（NS398）、EP2和EP4拮抗劑（AH6809和AH23848）、PK

15、A阻斷劑（KT5720和H89）明顯的抑制，這在一定程度上說明 BaP對COX-2的激發(fā)作用是從自由基攻擊開始的。隨后，通過COX-2衍生的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其作用的EP2/EP4受體和環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A，cAMP/PKA）信號通路來調(diào)控的。
　　本研究揭示了PM10及BaP對大腦神經(jīng)元的損