CREB1上調(diào)野生型BRAF基因表達在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥，Endometriosis）是一種常見的具有雌激素依賴性的慢性婦科病及難治病。其主要臨床特征是盆腔包塊、痛經(jīng)為典型特點的慢性盆腔痛和不孕等，并具有類似惡性腫瘤的廣泛種植及侵襲生長能力的生物學行為，其發(fā)病機制仍不清楚。越來越多的證據(jù)表明子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜尤其是分泌期在位內(nèi)膜異常的分子改變可以促進子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，因此對分泌期在位內(nèi)膜特異基因及其相關分子機制的探討可為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提供新的理論

2、依據(jù)。BRAF基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1(v-rafmurine sarcoma viral oncogene homologB1)，屬于RAS—RAF—MEK—ERK信號通路中的一員，該通路是一個重要的細胞功能通路，研究表明該通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。BRAF基因包括野生型(wtBRAF)及突變型(mutBRAF)，多數(shù)與惡性腫瘤相關的BRAF基因以突變型為主。另有研究發(fā)現(xiàn)，wtBRAF基因及蛋白過表達可以

3、激活ras-b-raf-mapk信號通路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜BRAF基因mRNA及蛋白相對表達量明顯增高，提示BRAF基因可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，然而在子宮內(nèi)膜異位癥中是否存在BRAF基因點突變以及wtBRAF基因過表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制仍是不明確的。CREB1(cAMP responsive element binding protein1)是研究較透徹的轉(zhuǎn)錄因子，屬于bZIP家族，

4、能增強其靶基因的表達促進細胞的增殖和分化。研究表明，CREB1在促進腫瘤細胞生長增殖中發(fā)揮著重要作用，具有癌基因的功能，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本課題組前期對子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜組織進行IncRNA芯片篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在位內(nèi)膜中CREB1 mRNA的相對表達水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜。然而CREB1在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達情況及其是否對wtBRAF基因表達具有調(diào)控作用卻是未知的。
　　方法：選

5、擇行全子宮切除術的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例為實驗組，根據(jù)月經(jīng)周期及病理驗證，留取分泌期在位內(nèi)膜，同時留取異位病灶。對照組為同期排除雌激素依賴性疾病患者的正常子宮內(nèi)膜。所有患者均月經(jīng)規(guī)律，無其他惡性疾病、雌激素依賴性疾病、免疫性疾病、外科疾病及炎癥疾病。術前6個月內(nèi)未接受GnRH類似物、激素類及抗炎藥物治療。利用Sanger測序檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中BRAF基因第11及15外顯子突變情況。利用NCBI、U

6、CSC、JASPAR、TRANSFAC等數(shù)據(jù)庫預測能夠與wtBRAF啟動子上游2000 bp區(qū)域內(nèi)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。利用實時熒光定量PCR技術、免疫組化及蛋白免疫印跡方法檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中wtBRAF與CREB1 mRNA和蛋白的表達情況并進行相關性分析。原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，利用實時熒光定量PCR技術、蛋白免疫印跡技術檢測wtBRAF、CREB1 mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及正常

7、子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達。子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞分別沉默wtBRAF、CREB1，正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞分別過表達wtBRAF、CREB1，蛋白免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染前后子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中wtBRAF及CREB1蛋白表達水平的改變。CCK-8細胞增殖實驗檢測wtBRAF及CREB1表達改變前后細胞增殖能力的改變。劃痕實驗檢測wtBRAF及CREB1表達改變前后細胞遷移能力的改變，Transwell細胞

8、侵襲實驗檢測wtBRAF及CREB1表達改變前后細胞侵襲能力的改變。雙熒光素酶報告實驗檢測CREB1過表達后wtBRAF基因啟動子熒光素酶活性改變。染色質(zhì)免疫共沉淀技術檢測CREB1與wtBRAF啟動子結(jié)合情況。實時熒光定量PCR技術、蛋白免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染CREB1前后wtBRAF mRNA和蛋白表達情況，蛋白免疫印跡檢測wtBRAF表達改變前后CyclinD1、ERK及p-ERK表達情況。
　　結(jié)果：⑴Sanger測序篩查報告顯

9、示30例子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位內(nèi)膜標本中未檢測到BRAF基因第11及15外顯子點突變的存在，均為野生型。接著我們利用種屬為人的JASPAR核心轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫預測能夠與wtBRAF啟動子上游2000bp區(qū)域內(nèi)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示共有323個（相關系數(shù)默認為80％)，其中相對評分大于1.000的基因為5個，分別是CREB1(cAMP responsiveelement binding protein1;NCBI Gene ID13

10、85), SPIB(Spi-B transcription factor;NCBI Gene ID6689), NFATC2(nuclear factor of activated T-cells2;NCBI Gene ID4773), ZNF354C(zinc finger protein354C; NCBI Gene ID30832), and SOX10(SRY-box10; NCBI Gene ID6663)。同時結(jié)合TRANS

11、FAC數(shù)據(jù)庫與JASPAR數(shù)據(jù)庫預測到CRE序列位點(TGACGTCA)位于wtBRAF轉(zhuǎn)錄起始位點上游（-266～-259 bp）。實時熒光定量PCR技術結(jié)果提示子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中wttBRAF、CREB1 mRNA相對表達量顯高于正常子宮內(nèi)膜(P＜0.001)，而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果提示wtBRAF蛋白定位表達于上皮及間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)，而CREB1蛋白定位表達于上皮及間質(zhì)

12、細胞的細胞核。正常內(nèi)膜組織中wtBRAF、CREB1蛋白表達的陽性率為24.0％、36.0％，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織中wtBRAF、CREB1蛋白陽性分別率為70.0％、80.0％，而同期的子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中CREB1蛋白陽性率分別為63.3％、76.0％。該結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中wtBRAF、CREB1蛋白的陽性表達率和表達強度均明顯高于正常內(nèi)膜(P＜0.05)，而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜兩組之間差異無

13、統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。蛋白免疫印跡方法檢測結(jié)果提示子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中wtBRAF、CREB1蛋白相對表達量明顯高于正常內(nèi)膜(P＜0.05)，而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。且通過Pearson's相關性分析發(fā)現(xiàn)CREB1蛋白表達水平與wtBRAF mRNA(R=0.417，P＜0.001)及蛋白(R=0.529，P＜0.001)表達水平均存在正相關。⑵實時熒光定量PCR技術及蛋白免疫印跡結(jié)果

14、提示子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞wtBRAF及CREB1 mRNA及蛋白表達水平較對照組正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞顯著增高。在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中分別沉默wtBRAF基因及CREB1基因，細胞的增殖及遷移侵襲能力明顯減弱，而在正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中分別過表達wtBRAF基因及CREB1基因，細胞的增殖及遷移侵襲能力明顯增強。⑶Pearson's相關性分析發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CREB1蛋白

15、表達水平與wtBRAF mRNA(R=0.609，P＜0.01)及蛋白(R=0.644，P＜0.01)表達水平均存在正相關。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示wtBRAF啟動子和CREB1 cDNA共轉(zhuǎn)染組與陰性對照組相比，熒光素酶活性明顯升高。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果提示與CREB1結(jié)合的DNA片段中存在wtBRAF基因的啟動子序列。⑷子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞沉默CREB1基因后wtBRAF mRNA及蛋白表達水平明顯降低。在正常子宮內(nèi)膜

16、間質(zhì)細胞中過表達CREB1基因后wtBRAF mRNA及蛋白表達水平明顯升高。在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中沉默wtBRAF基因，CyclinD1表達明顯下降，磷酸化ERK的表達明顯降低，總ERK表達水平未見明顯改變;在正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中過表達wtBRAF基因Cyclin D1表達明顯升高，磷酸化ERK的表達明顯升高，總ERK表達水平未見明顯改變。
　　結(jié)論：①BRAF基因第11及15外顯子點突變可能不參與子宮內(nèi)膜異位