鉛鎘聯(lián)合對新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷及NAC保護效應的研究.pdf

1、近年來，對環(huán)境化學物毒性危害的研究已由原來單一因素為主向因素間聯(lián)合作用方向發(fā)展。鉛、鎘均是生產(chǎn)和生活中接觸頻率大、暴露范圍廣的蓄積性毒物，能對發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。鉛、鎘單獨作用的報道較多，而對兩者的聯(lián)合毒性研究則相對較少，尤其是鉛鎘聯(lián)合對處于發(fā)育早期的動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷的系統(tǒng)研究較為罕見。本研究選用新生大鼠作為試驗動物，通過體外和體內(nèi)實驗相結(jié)合的方法較系統(tǒng)的探討了鉛、鎘及其聯(lián)合對新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷效應及其

2、可能的作用機理，為進一步認識鉛、鎘及其聯(lián)合毒性作用提供理論依據(jù)。 一、體外試驗選用新生24h內(nèi)SD大鼠作為試驗用神經(jīng)細胞的來源，采用尼氏染色對皮質(zhì)神經(jīng)細胞進行了形態(tài)鑒定和純度分析，用CCK-8法檢測了一個生長周期內(nèi)神經(jīng)細胞的活性分布，成功建立了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞毒性試驗的體外培養(yǎng)模型；在此基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中添加不同濃度的Pb、Cd，共分9組，分別為對照組、P1(Pb100μmol／L)、P2(Pb 200μmol／L)、Cl(Cd

3、 5μmol／L)、C2(Cd 10μmol／L)、P1C1(Pb100μmol／L+Cd 5μmol／L)、P1C2(Pb 100μmol／L+Cd 10μmol／L)、P2C1(Pb200μmol／L+Cd 5μmol／L)、P2C2(Pb 200μmol／L+Cd 10μmol／L)組。分別從神經(jīng)細胞形態(tài)學、神經(jīng)細胞存活率、神經(jīng)細胞凋亡率以及神經(jīng)細胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量等方面對鉛、鎘損傷新生大鼠大

4、腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞進行了研究；同時，添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)，觀察其在鉛鎘損傷神經(jīng)細胞過程中的保護效果。結(jié)果表明，①本試驗培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞，經(jīng)尼氏染色鑒定并計數(shù)神經(jīng)細胞純度在92％以上，且在一個生長周期內(nèi)培養(yǎng)至第6d時神經(jīng)細胞的OD值最高，因此，本試驗將第6d確定為鉛鎘處理神經(jīng)細胞的時間；②與對照組相比，鉛、鎘及其聯(lián)合均能導致神經(jīng)細胞數(shù)量減少、網(wǎng)絡減少或消失；能使胞體短直徑和突起長度顯著變小和縮短(P<0.05)；使神經(jīng)細胞的存

5、活率顯著下降(P<0.05)，且具有明顯的時間與劑量效應；各染毒組神經(jīng)細胞核皺縮、呈新月形、染色質(zhì)致密濃染，甚至出現(xiàn)核碎裂，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與相應單獨染毒組比較，各聯(lián)合染毒組上述指標變化更為嚴重，P1C2組較P2C1組改變明顯，其中以P2C2組最為顯著(P<0.05)；③與對照組比較，各染毒組神經(jīng)細胞GSH-Px、SOD、TChE活性均顯著下降(P<0.05)，而CAT活性和MDA含量則顯著升高(P<0.05)；④在

6、NAC拮抗鉛、鎘及其聯(lián)合毒性試驗中，可以看出NAC能使神經(jīng)細胞存活率升高、細胞凋亡率下降，能使GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性升高及MDA含量下降，但無顯著性差異(P>0.05)。 由上述試驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論：①鉛、鎘及其聯(lián)合能使神經(jīng)細胞胞體變小，神經(jīng)細胞突起變短，神經(jīng)細胞間網(wǎng)絡連接減少；能使神經(jīng)細胞存活率下降，神經(jīng)細胞凋亡率增加，且具有明顯的時間和劑量效應。鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應，其中鎘在聯(lián)合作用中發(fā)揮主導作用

7、；②鉛、鎘及其聯(lián)合能顯著改變神經(jīng)細胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量，因此，鉛、鎘的神經(jīng)系統(tǒng)毒性與其脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)；③添加NAC可以提高神經(jīng)細胞的存活率，減少凋亡細胞的數(shù)量，增加GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性，減少MDA的生成，說明NAC具有一定的拮抗鉛、鎘毒性損傷的作用，但保護效果不明顯。二、體內(nèi)試驗 35只懷孕母鼠被隨機分為7組，分別為對照組(飲用蒸餾水)、鉛組(300mg／L)、鉛+NAC組(

8、300mg／L+20mmol／L)、鎘組(10mg／L)、鎘+NAC組(10mg／L+20mmol／L)、鉛鎘聯(lián)合組(300mg／L+10mg／L)、鉛鎘聯(lián)合+NAC組(300mg/L+10mg／L+20mmol／L)。經(jīng)飲水染毒，染毒時間為整個妊娠期，待分娩后觀察并記錄：①鉛、鎘及其聯(lián)合對新生鼠生長發(fā)育的影響；②用光學顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察新生鼠大腦皮質(zhì)組織病理學及超微結(jié)構(gòu)的變化；③測定新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、CAT、T

9、ChE活性及MDA含量；④ICP-MS檢測了新生鼠體內(nèi)主要微量元素Cu、Fe、Zn、Mn及Se含量；⑤FQ-PCR法檢測了凋亡基因bcl-2、Bax和c-fos在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達；免疫組織化學和FQ-PCR法檢測了MT-3在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達研究；⑥同時進行了相關(guān)指標的NAC保護試驗研究。結(jié)果表明，①與對照組比較，各染毒組新生鼠體重和腦重均明顯下降(P<0.05或P>0.05)，其中以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯；②新生鼠大腦皮質(zhì)組

10、織經(jīng)HE染色未見明顯異常的病理組織學變化，但超微結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)神經(jīng)細胞核固縮、變形，染色質(zhì)邊聚、輕度溶解，線粒體腫脹、嵴部分或完全消失，鉛鎘聯(lián)合對新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的損傷較鉛、鎘單獨時嚴重；③各染毒組新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均顯著低于對照組(P<0.05)，以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯；④與對照組相比，鉛、鎘及其聯(lián)合均使新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT。活性下降及MDA含量升高(P<0.0

11、5或P>0.05)；⑤各染毒組新生鼠大腦皮質(zhì)bcl-2基因的表達均低于對照組(P<0.05或P>0.05)，而Bax、c-fos和MT-3表達則顯著高于對照組(P<0.05)；⑥NAC保護組與相應染毒組比較，新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均有所升高(P<0.05或P>0.05)，腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性均有不同程度升高但差異不顯著(P>0.05)，MDA含量則顯著下降(P<0.05)，大腦皮質(zhì)

12、bcl-2基因的表達量明顯增加(P<0.05或P>0.05)，而Bar和c-fos表達則顯著減少(P<0.05)。 通過對本部分試驗結(jié)果的分析，可得出以下結(jié)論：①母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露能明顯減輕新生鼠體重和腦重，導致新生鼠腦發(fā)育遲緩；②母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露對新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)有顯著影響，導致細胞膜破裂，細胞核固縮、變形，線粒體腫脹、嵴部分或完全消失；③鉛、鎘及其聯(lián)合導致機體抗氧化酶活性降低可能與其微量元素Cu、

13、Fe、Zn、Mn和Se含量下降有關(guān)；④鉛、鎘及其聯(lián)合誘導神經(jīng)細胞凋亡與bcl-2、Bax、c-fos基因的異常表達有關(guān)，鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應；⑤母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露的同時添加NAC可以提高新生鼠體重和腦重，新生鼠體內(nèi)微量元素的含量增加，使新生鼠腦組織內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性升高，MDA含量顯著降低，能增加bcl-2的表達量、減少Bax、c-fos和MT-3的表達量，表明NAC對鉛、鎘毒性損傷具有一定的保護