STIM1抗體封閉對(duì)fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性及趨化性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)機(jī)體遭受外來(lái)細(xì)菌和病原體入侵時(shí),充當(dāng)?shù)谝坏婪谰€,它們的主要功能是滲出血管壁并遷移到炎癥灶,通過(guò)吞噬作用和釋放超氧化物和/或蛋白水解酶殺死細(xì)菌和入侵的微生物。這種外滲和遷移的機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞的極性和趨化性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。臨床上一些疾病例如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷和器官移植的排斥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏反應(yīng)、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都與中

2、性粒細(xì)胞極性功能的增強(qiáng)和減弱有關(guān)。因此深入探討中性粒細(xì)胞極性調(diào)節(jié)機(jī)制為抵抗中性粒細(xì)胞激活導(dǎo)致的機(jī)體組織損傷尋找到新的干預(yù)和治療靶點(diǎn)。
　　 鈣信號(hào)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多重要生理、病理過(guò)程,胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高依賴(lài)于兩種途徑:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放和細(xì)胞膜外鈣內(nèi)流。鈣池操縱的鈣流入(store-operatedcalcium entry,SOCE)是非興奮細(xì)胞的主要鈣流入形式。近年來(lái)隨著蛋白基質(zhì)交互分子(stromal interaction

3、molecule,STIM)的發(fā)現(xiàn),將SOCE調(diào)控機(jī)制的研究向前推進(jìn)了一步。Liou,Roos等證實(shí)了STIM1而非STIM2調(diào)控著SOCE。STIM1作為SOCE的關(guān)鍵分子,主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)內(nèi),也有少量分布于質(zhì)膜(plasma membrane,PM)上,它包含著一個(gè)定位于ER內(nèi)的EF-hand基序,充當(dāng)著鈣離子感受器的角色。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)SOCE在細(xì)胞極性及趨化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但對(duì)

4、于STIM1分子在其中的作用及作用機(jī)制缺乏研究。
　　 細(xì)胞的極性機(jī)制研究中存在著依賴(lài)P13K和非依賴(lài)P13K兩條途徑。P13K-Akt被認(rèn)為是經(jīng)典的極性信號(hào)通路,也有研究表明酪氨酸激酶Src、Rho小G蛋白參與極性形成、細(xì)胞的遷移、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。而對(duì)于fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性及趨化過(guò)程中是否也存在這樣的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。
　　 人中性粒細(xì)胞為終末血細(xì)胞,在體外存活時(shí)間短,難于進(jìn)行基因操作或RNA干擾,那

5、么電轉(zhuǎn)抗體封閉技術(shù)對(duì)于這種短時(shí)程的研究不失為一種行之有效的手段。為了闡明SOCE在人中性粒細(xì)胞極性及趨化性的作用以及調(diào)控機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用此技術(shù)封閉細(xì)胞內(nèi)STIM1蛋白分子,觀察其對(duì)中性粒細(xì)胞趨化率的影響,以及相關(guān)的信號(hào)蛋白分子Akt,Src,Pho小G蛋白的變化。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究STIM1抗體封閉后對(duì)fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性及趨化性的影響,探討SOCE在人中性粒細(xì)胞極性及趨化性中的作用及其調(diào)控機(jī)

6、制。
　　 方法：
　　 1.采用Dextran作用下紅細(xì)胞自然沉降,Ficoll-Hypaque密度梯度離心,低滲裂解紅細(xì)胞的方法急性分離人外周血中性粒細(xì)胞。
　　 2.使用電轉(zhuǎn)儀將anti-STIM1抗體轉(zhuǎn)入人中性粒細(xì)胞內(nèi)以進(jìn)行后續(xù)的人中性粒細(xì)胞極性及趨化性的研究。
　　 3.采用Immunoprecipitation和Western blotting檢測(cè)anti-STIM1抗體電轉(zhuǎn)效果。
　　

7、 4.使用Zigmond chamber觀察STIM1抗體封閉后fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞趨化率的變化。
　　 5.應(yīng)用GST pull-down and Western blotting方法檢測(cè)STIM1抗體封閉后fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性及趨化過(guò)程中相關(guān)信號(hào)分子的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Immunoprecipitation和Western blotting檢測(cè)anti-STIM1抗體電轉(zhuǎn)效率顯

8、著,電轉(zhuǎn)anti-STIM1抗體組檢測(cè)到的蛋白信號(hào)強(qiáng)于非電轉(zhuǎn)組(P<0.001)。
　　 2.Control組、IgG組、anti-STIM1三組間趨化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),趨化率的大小為Control組>IgG組>anti-STIM1組。
　　 3.免疫印跡結(jié)果顯示Control組加與不加fMLP刺激p-Akt檢測(cè)到的蛋白條帶信號(hào)很弱,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.505),Src磷酸化以及Rac1,R

9、ac2,Cdc42活化水平加fMLP刺激后高于不加fMLP(P<0.001)；IgG組有著相同趨勢(shì),p-Akt無(wú)變化(P=0.766),p-Src,GTP-Rac1,GTP-Rac2,GTP-Cdc42在fMLP刺激后其含量高于不加fMLP(P<0.001):anti-STIM1組p-Akt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.476),p-Src(=0.315),GTP-Rac1(P=0.944),GTP-Rac2(P=0.386),GTP-Cd