鈣信號(hào)參與中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)是具有定向移動(dòng)功能的吞噬細(xì)胞,在抵抗細(xì)菌和真菌感染的宿主反應(yīng)中起著重要的作用,這種功能是依靠趨化能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的,趨化性是細(xì)胞感受信號(hào)分子從而具有的定向移動(dòng)的能力,中性粒細(xì)胞能夠沿著趨化物濃度梯度定向遷移到急性炎癥的位置,這種遷移是中性粒細(xì)胞的核心功能。中性粒細(xì)胞能夠遷移的基礎(chǔ)在于其具有接受趨化刺激時(shí)具有形成極性化形狀的能力。 Ca2+信號(hào)在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和執(zhí)行功能等各個(gè)方面都發(fā)揮著重要的作用,影響著從卵子

2、受精到細(xì)胞凋亡的整個(gè)生命過(guò)程。Ca2+的獨(dú)特性質(zhì)在于其既能充當(dāng)?shù)谝恍攀挂材艹洚?dāng)?shù)诙攀?;既能調(diào)控細(xì)胞的生命過(guò)程,又能進(jìn)行自身的調(diào)控。胞外Ca2+濃度常超過(guò)10-3M,而胞內(nèi)至少低于胞外四個(gè)數(shù)量級(jí)之多(10-7M),細(xì)胞這種Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持依靠一些重要的調(diào)節(jié)區(qū)域通過(guò)一系列精妙的方式進(jìn)行嚴(yán)密的控制和調(diào)節(jié)。在細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上,一些蛋白質(zhì)形成的離子通道,其主要功能是通透Ca2+,這些離子通道依據(jù)門控機(jī)制分屬于三組:電壓門控性通道、配體門控性

3、通道和庫(kù)作性鈣離子通道(Store-operated channels)。 1986年James Putney提出了庫(kù)作性鈣內(nèi)流(SOCE)的概念。一組選擇性刺激可以誘發(fā)細(xì)胞的應(yīng)答,激活細(xì)胞表面受體從而誘導(dǎo)了胞膜磷酸肌醇的水解。通過(guò)磷脂酶C(PLC)產(chǎn)生活動(dòng)性鈣信號(hào)Inositol1,4,5-trisphosphate[Ins(1,4,5)P3],從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)鈣庫(kù)釋放鈣離子。同時(shí),鈣離子的釋放伴隨著外鈣的內(nèi)流。由于胞外鈣離子

4、的內(nèi)流是由胞內(nèi)鈣庫(kù)鈣離子的釋放傾空引起的,所以稱為庫(kù)作性鈣內(nèi)流。SOCE已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并提出多年,但其機(jī)制一直不甚清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上分布的感受分子Stim1和胞膜上的Orai1等分子相互作用有關(guān)。隨著人們對(duì)SOCE機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐漸發(fā)展,研究SOCE機(jī)制的工具藥也逐漸受到人們的重視,其中普遍使用的有SK&F96365和2-APB。 中性粒細(xì)胞在受到趨化劑刺激后發(fā)生極性化的過(guò)程中,胞內(nèi)Ca2+濃度和分布會(huì)發(fā)生一系列改變。PM

5、Ns趨化劑甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫(kù)釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫(kù)釋放可以激活SOCE通路,促進(jìn)外鈣的內(nèi)流。但SOCE機(jī)制是否參與中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程以及在此過(guò)程中起何種作用,阻斷SOCE后對(duì)中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程以及趨化性有何影響,尚無(wú)確切報(bào)道。 SOCE在細(xì)胞極性化過(guò)程中可能起著重要的作用,而且這種作用可能與胞膜上脂筏(Lipid raft)結(jié)構(gòu)存在密切的關(guān)系

6、。脂筏的關(guān)鍵功能是它們能夠作為信號(hào)的平臺(tái)。為了進(jìn)一步理解SOCE和脂筏的關(guān)系,我們觀察了mβCD(甲基-β-環(huán)糊精,Methyl-β-cyclodextrin)對(duì)中性粒細(xì)胞極性的影響。mβCD能夠清空中性粒細(xì)胞膽固醇,破壞脂筏完整性,從而可能影響到極性的形成過(guò)程。 目的: 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的變化,以及應(yīng)用工具藥作用于SOCE機(jī)制后對(duì)細(xì)胞極性和趨化性的影響,探討SOCE機(jī)制在中性粒細(xì)胞極

7、性化過(guò)程中的作用。 方法: 1.采用重復(fù)梯度密度離心的方法(Percoll非連續(xù)密度梯度離心法),急性分離并純化健康成人靜脈血中性粒細(xì)胞,分離純化后的中性粒細(xì)胞進(jìn)行4℃溫度預(yù)處理備用。 2.使用激光共聚焦顯微鏡,觀察不同處理因素下加入趨化劑fMLP時(shí)中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+瞬間動(dòng)態(tài)變化,以確定SOCE機(jī)制是否參與中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程。根據(jù)處理因素不同分為四組:空鈣組(細(xì)胞外液使用無(wú)鈣HEPEs液)、正常鈣組(細(xì)胞

8、外液使用含有1mM鈣離子的HEPEs液)、高鈣組(細(xì)胞外液使用含有2mM鈣離子的HEPEs液)和2-APB組(細(xì)胞外液使用含有1mM鈣離子的HEPEs液并使用SOCE阻斷劑2-APB100nM孵育15分鐘)。 3.使用膜片鉗,全細(xì)胞模式電壓鉗下,在不同protocol下記錄不同藥物預(yù)處理后加入趨化劑時(shí)全細(xì)胞電流的變化。以觀測(cè)在中性粒細(xì)胞極性過(guò)程中SOCC通道電流是否參與,從而進(jìn)一步確定SOCE機(jī)制是否參與中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程,以

9、及SOCE機(jī)制在中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中的作用。根據(jù)處理方法不同分組,分別為:Control組(對(duì)照組,不使用任何藥物預(yù)處理,其后也不加入趨化劑fMLP)、fMLP組(不使用任何藥物預(yù)處理,其后和實(shí)驗(yàn)組以相同方法加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP)、SKF96365組(使用SOCE阻斷劑SKF9636510μM孵育15分鐘后,加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP)、2-APB組(使用SOCE阻斷劑2-APB100nM孵育15分鐘后,

10、加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP)和TG組(使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)傾空藥物TG100nM孵育15分鐘后,加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP)。 4.采用流式細(xì)胞術(shù),觀察不同藥物處理下加入趨化劑后,中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中標(biāo)志性蛋白分子——極性相關(guān)骨架蛋白(F-actin)的免疫熒光變化。以觀察SOCE阻斷劑SKF96365、2-APB和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)傾空劑TG對(duì)細(xì)胞極性變化的影響,從而確定SOCE機(jī)制在中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中的作用。

11、根據(jù)文獻(xiàn)選擇在加入趨化劑fMLP后0s(即不加fMLP)、10s、30s、60s、120s和240s這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同組間的F-actin免疫熒光的變化差異。分組方法基本同膜片鉗實(shí)驗(yàn)分組方法。 5.采用Transwell方法,觀察不同藥物處理后中性粒細(xì)胞的趨化性,分析SOCE機(jī)制和脂筏在中性粒細(xì)胞趨化過(guò)程中的作用。小室下室放入含fMLP100nM的RMPI1640300μL,上室加入經(jīng)不同藥物處理后的中性粒細(xì)胞懸液

12、100μL[分別經(jīng)TG100nM(TG組),2-APB100nM(2-APB組),SKF9636510μM(SKF96365組)和mβCD10mM(mβCD組)處理,37℃,5%CO2孵箱內(nèi)孵育15分鐘],并設(shè)fMLP對(duì)照組(上室加入DMSO,劑量同溶解上述藥物所用量,即fMLP組)。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(上室加入DMSO,下室加入PBS液,劑量同溶解上述藥物所用量,即Control組)。 結(jié)果: 1.空鈣組加入100nM

13、fMLP后中性粒細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+熒光值變化標(biāo)準(zhǔn)化比值顯著小于正常鈣組(n=9,P=0.027)。2-APB組中性粒細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+熒光值變化標(biāo)準(zhǔn)化比值顯著小于正常鈣組(n=9,P=0.005)。 2.正常狀態(tài)下中性粒細(xì)胞,加入終濃度100nM fMLP后,全細(xì)胞內(nèi)向電流開始明顯增加。持續(xù)一分鐘之后緩慢下降并持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。經(jīng)SKF9636510μM、2-APB100nM孵育15分鐘后加入終濃度100nM fMLP,全細(xì)胞內(nèi)向電

14、流的增加(以鉗制電位為-80mV時(shí)為例)顯著被抑制(在step protocol下分別為P=0.004和P=0.022;在ramp protocol下分別為P=0.030和P=0.043)。經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)傾空劑TG100nM孵育15分鐘后,全細(xì)胞內(nèi)向電流顯著增大(在step protocol下為P=0.002;在ramp protocol下為P=0.002),加入終濃度100nM fMLP后全細(xì)胞內(nèi)向電流增加不明顯。 3.在fML

15、P作用240秒的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)2-APB預(yù)孵育組F-actin熒光值顯著小于fMLP組(P=0.036),各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)SKF96365預(yù)孵育組和2-APB預(yù)孵育組胞內(nèi)F-actin熒光值的均值均小于fMLP組。 4.2-APB預(yù)孵育組中性粒細(xì)胞趨化遷移能力顯著小于fMLP組(P=0.034),SKF96365和mβCD預(yù)孵育組中性粒細(xì)胞趨化遷移率標(biāo)準(zhǔn)化比值均數(shù)小于fMLP組。 結(jié)論: 1.中性粒細(xì)胞經(jīng)趨化劑fMLP處理后

16、,胞內(nèi)鈣離子濃度的升高包含兩部分來(lái)源,即胞內(nèi)鈣庫(kù)的鈣離子釋放和胞外鈣離子的流入。fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中胞外鈣離子的流入主要是通過(guò)SOCC通道完成的。SOCE機(jī)制在fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中胞外鈣離子的流入過(guò)程中起重要作用。 2.中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中,SOCC通道占有重要地位,SOCE機(jī)制起了重要作用。同時(shí)可能存在其它鈣離子通道和鈣離子內(nèi)流機(jī)制參與了中性粒細(xì)胞的極性化過(guò)程。 3.SOCE參與了中性

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