鈣信號參與中性粒細胞極性化過程的研究.pdf

1、嗜中性粒細胞（PMNs）是具有定向移動功能的吞噬細胞，在抵抗細菌和真菌感染的宿主反應中起著重要的作用，這種功能是依靠趨化能力來實現(xiàn)的，趨化性是細胞感受信號分子從而具有的定向移動的能力，中性粒細胞能夠沿著趨化物濃度梯度定向遷移到急性炎癥的位置，這種遷移是中性粒細胞的核心功能。中性粒細胞能夠遷移的基礎在于其具有接受趨化刺激時具有形成極性化形狀的能力。 Ca2+信號在細胞的信號傳導和執(zhí)行功能等各個方面都發(fā)揮著重要的作用，影響著從卵子

2、受精到細胞凋亡的整個生命過程。Ca2+的獨特性質(zhì)在于其既能充當?shù)谝恍攀挂材艹洚數(shù)诙攀?；既能調(diào)控細胞的生命過程，又能進行自身的調(diào)控。胞外Ca2+濃度常超過10-3M，而胞內(nèi)至少低于胞外四個數(shù)量級之多（10-7M），細胞這種Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持依靠一些重要的調(diào)節(jié)區(qū)域通過一系列精妙的方式進行嚴密的控制和調(diào)節(jié)。在細胞膜或細胞器膜上，一些蛋白質(zhì)形成的離子通道，其主要功能是通透Ca2+，這些離子通道依據(jù)門控機制分屬于三組：電壓門控性通道、配體門控性

3、通道和庫作性鈣離子通道（Store-operated channels）。 1986年James Putney提出了庫作性鈣內(nèi)流（SOCE）的概念。一組選擇性刺激可以誘發(fā)細胞的應答，激活細胞表面受體從而誘導了胞膜磷酸肌醇的水解。通過磷脂酶C（PLC）產(chǎn)生活動性鈣信號Inositol1，4，5-trisphosphate[Ins（1，4，5）P3]，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）鈣庫釋放鈣離子。同時，鈣離子的釋放伴隨著外鈣的內(nèi)流。由于胞外鈣離子

4、的內(nèi)流是由胞內(nèi)鈣庫鈣離子的釋放傾空引起的，所以稱為庫作性鈣內(nèi)流。SOCE已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并提出多年，但其機制一直不甚清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上分布的感受分子Stim1和胞膜上的Orai1等分子相互作用有關。隨著人們對SOCE機制認識的逐漸發(fā)展，研究SOCE機制的工具藥也逐漸受到人們的重視，其中普遍使用的有SK&F96365和2-APB。 中性粒細胞在受到趨化劑刺激后發(fā)生極性化的過程中，胞內(nèi)Ca2+濃度和分布會發(fā)生一系列改變。PM

5、Ns趨化劑甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫釋放可以激活SOCE通路，促進外鈣的內(nèi)流。但SOCE機制是否參與中性粒細胞極性化過程以及在此過程中起何種作用，阻斷SOCE后對中性粒細胞極性化過程以及趨化性有何影響，尚無確切報道。 SOCE在細胞極性化過程中可能起著重要的作用，而且這種作用可能與胞膜上脂筏（Lipid raft）結(jié)構存在密切的關系

6、。脂筏的關鍵功能是它們能夠作為信號的平臺。為了進一步理解SOCE和脂筏的關系，我們觀察了mβCD（甲基-β-環(huán)糊精，Methyl-β-cyclodextrin）對中性粒細胞極性的影響。mβCD能夠清空中性粒細胞膽固醇，破壞脂筏完整性，從而可能影響到極性的形成過程。 目的: 本實驗通過研究中性粒細胞極性化過程中胞內(nèi)Ca2+信號的變化，以及應用工具藥作用于SOCE機制后對細胞極性和趨化性的影響，探討SOCE機制在中性粒細胞極

7、性化過程中的作用。 方法: 1.采用重復梯度密度離心的方法（Percoll非連續(xù)密度梯度離心法），急性分離并純化健康成人靜脈血中性粒細胞，分離純化后的中性粒細胞進行4℃溫度預處理備用。 2.使用激光共聚焦顯微鏡，觀察不同處理因素下加入趨化劑fMLP時中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+瞬間動態(tài)變化，以確定SOCE機制是否參與中性粒細胞極性化過程。根據(jù)處理因素不同分為四組：空鈣組（細胞外液使用無鈣HEPEs液）、正常鈣組（細胞

8、外液使用含有1mM鈣離子的HEPEs液）、高鈣組（細胞外液使用含有2mM鈣離子的HEPEs液）和2-APB組（細胞外液使用含有1mM鈣離子的HEPEs液并使用SOCE阻斷劑2-APB100nM孵育15分鐘）。 3.使用膜片鉗，全細胞模式電壓鉗下，在不同protocol下記錄不同藥物預處理后加入趨化劑時全細胞電流的變化。以觀測在中性粒細胞極性過程中SOCC通道電流是否參與，從而進一步確定SOCE機制是否參與中性粒細胞極性化過程，以

9、及SOCE機制在中性粒細胞極性化過程中的作用。根據(jù)處理方法不同分組，分別為：Control組（對照組，不使用任何藥物預處理，其后也不加入趨化劑fMLP）、fMLP組（不使用任何藥物預處理，其后和實驗組以相同方法加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP）、SKF96365組（使用SOCE阻斷劑SKF9636510μM孵育15分鐘后，加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP）、2-APB組（使用SOCE阻斷劑2-APB100nM孵育15分鐘后，

10、加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP）和TG組（使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫傾空藥物TG100nM孵育15分鐘后，加入終濃度為100nM的趨化劑fMLP）。 4.采用流式細胞術，觀察不同藥物處理下加入趨化劑后，中性粒細胞極性化過程中標志性蛋白分子——極性相關骨架蛋白（F-actin）的免疫熒光變化。以觀察SOCE阻斷劑SKF96365、2-APB和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫傾空劑TG對細胞極性變化的影響，從而確定SOCE機制在中性粒細胞極性化過程中的作用。

11、根據(jù)文獻選擇在加入趨化劑fMLP后0s（即不加fMLP）、10s、30s、60s、120s和240s這6個時間點內(nèi)比較各個時間點不同組間的F-actin免疫熒光的變化差異。分組方法基本同膜片鉗實驗分組方法。 5.采用Transwell方法，觀察不同藥物處理后中性粒細胞的趨化性，分析SOCE機制和脂筏在中性粒細胞趨化過程中的作用。小室下室放入含fMLP100nM的RMPI1640300μL，上室加入經(jīng)不同藥物處理后的中性粒細胞懸液

12、100μL[分別經(jīng)TG100nM（TG組），2-APB100nM（2-APB組），SKF9636510μM（SKF96365組）和mβCD10mM（mβCD組）處理，37℃，5%CO2孵箱內(nèi)孵育15分鐘]，并設fMLP對照組（上室加入DMSO，劑量同溶解上述藥物所用量，即fMLP組）。同時設空白對照組（上室加入DMSO，下室加入PBS液，劑量同溶解上述藥物所用量，即Control組）。 結(jié)果: 1.空鈣組加入100nM

13、fMLP后中性粒細胞胞內(nèi)Ca2+熒光值變化標準化比值顯著小于正常鈣組（n=9，P=0.027）。2-APB組中性粒細胞胞內(nèi)Ca2+熒光值變化標準化比值顯著小于正常鈣組（n=9，P=0.005）。 2.正常狀態(tài)下中性粒細胞，加入終濃度100nM fMLP后，全細胞內(nèi)向電流開始明顯增加。持續(xù)一分鐘之后緩慢下降并持續(xù)很長一段時間。經(jīng)SKF9636510μM、2-APB100nM孵育15分鐘后加入終濃度100nM fMLP，全細胞內(nèi)向電

14、流的增加（以鉗制電位為-80mV時為例）顯著被抑制（在step protocol下分別為P=0.004和P=0.022；在ramp protocol下分別為P=0.030和P=0.043）。經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫傾空劑TG100nM孵育15分鐘后，全細胞內(nèi)向電流顯著增大（在step protocol下為P=0.002；在ramp protocol下為P=0.002），加入終濃度100nM fMLP后全細胞內(nèi)向電流增加不明顯。 3.在fML

15、P作用240秒的時間點內(nèi)2-APB預孵育組F-actin熒光值顯著小于fMLP組（P=0.036），各時間點內(nèi)SKF96365預孵育組和2-APB預孵育組胞內(nèi)F-actin熒光值的均值均小于fMLP組。 4.2-APB預孵育組中性粒細胞趨化遷移能力顯著小于fMLP組（P=0.034），SKF96365和mβCD預孵育組中性粒細胞趨化遷移率標準化比值均數(shù)小于fMLP組。 結(jié)論: 1.中性粒細胞經(jīng)趨化劑fMLP處理后

16、，胞內(nèi)鈣離子濃度的升高包含兩部分來源，即胞內(nèi)鈣庫的鈣離子釋放和胞外鈣離子的流入。fMLP誘導的中性粒細胞極性化過程中胞外鈣離子的流入主要是通過SOCC通道完成的。SOCE機制在fMLP誘導的中性粒細胞極性化過程中胞外鈣離子的流入過程中起重要作用。 2.中性粒細胞極性化過程中，SOCC通道占有重要地位，SOCE機制起了重要作用。同時可能存在其它鈣離子通道和鈣離子內(nèi)流機制參與了中性粒細胞的極性化過程。 3.SOCE參與了中性