“雙固一通”針?lè)▽?duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：
　　 觀察“雙固一通”針?lè)▽?duì)去卵巢絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausalosteoporosis，PMO)模型大鼠調(diào)節(jié)骨吸收平衡的相關(guān)細(xì)胞因子系統(tǒng)--護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptoractivator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear

2、 factor-κB，RANK)系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步探討“雙固一通”針?lè)ㄖ委煴静〉淖饔脵C(jī)制，為針灸治療PMO提供新的思路和方法，為臨床預(yù)防和治療PMO提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 依隨機(jī)原則將50只SD大鼠分為對(duì)照組、模型組、常規(guī)取穴針刺組(簡(jiǎn)稱常規(guī)組)、“雙固一通”針刺組(簡(jiǎn)稱雙固一通組)和中成藥治療組(簡(jiǎn)稱中成藥組)，每組10只。模型組、常規(guī)組、雙固一通組和中成藥組切除雙側(cè)卵巢后常規(guī)飼養(yǎng)，造成實(shí)驗(yàn)性PMO動(dòng)物模型

3、。90天后常規(guī)組、雙固一通組采用電針治療，中成藥組早晚予仙靈骨葆膠囊灌胃治療(早晚以0.4g/次灌胃，藥液量以生理鹽水溶解，調(diào)整至3ml)，對(duì)照組、模型組早晚予生理鹽水3ml灌胃，用藥期間常規(guī)飼養(yǎng)。療程均為8周。電針治療(采用四川恒明科技開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)HM-6805型經(jīng)穴治療儀，疏密波8～80Hz，疏密波轉(zhuǎn)換14次/分鐘，電壓1.5V，強(qiáng)度1mA左右，通電15min)，每天1次，每次15分鐘，留針10分鐘，連續(xù)治療6天后休息1天，共治

4、療8周。常規(guī)組取穴：脾俞、胃俞、腎俞，氣海俞，均為雙側(cè)；雙固一通組取關(guān)元、后三里(雙)、腎俞(雙)、膈俞(雙)、大杼(雙)。用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和尿鈣、尿磷、尿肌酐；用放射免疫法測(cè)定血骨鈣素(Osteocalcin，BGP)；用酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELI

5、SA)測(cè)定尿脫氧吡啶啉(Deoxypyridinoline，DPD)的含量；用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)雌二醇(estradiol，E2)；ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素(interletukin，IL)-6、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、OPG、RANKL、RANK；雙能X線骨密度儀檢測(cè)骨密度(bone mass density，BMD)；HE染色觀察大鼠骨組織形

6、態(tài)學(xué)的變化；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測(cè)M-CSF、OPG、RANKL-mRNA表達(dá)及OPG/RANKL。大鼠因造模手術(shù)、麻醉、灌胃死亡，取材時(shí)各組大鼠數(shù)量如下：對(duì)照組8只，模型組6只，中成藥組6只，常規(guī)組6只，雙固一通組7只。
　　 結(jié)果：
　　 1模型組血Ca值明顯降低、血P值明顯升高、血ALP值明顯升高、BGP明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01

7、).與模型組比較，雙固一通組和中成藥組血Ca明顯升高、血P明顯降低、血ALP明顯降低，BGP明顯升高有非常顯著性差異(P<0.01)；雙固一通組優(yōu)于常規(guī)組(P<0.01)。
　　 模型組尿Ca/Cr、P/Cr比值明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，各組Ca/Cr、P/Cr比值均降低，常規(guī)組有非常顯著性差異(P<0.01)，雙固一通組Ca/Cr有非常顯著性差異(P<0.01)，P/Cr有顯著性差異(P<0.0

8、5)；雙固一通組與中成藥組和常規(guī)組比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 模型組尿DPD明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)。與模型組比較，雙固一通組尿DPD含量明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)；雙固一通組與中成藥組和常規(guī)組比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 模型組血Ca明顯降低、而血P、ALP值明顯升高、血BGP明顯升高(P<0.01)；尿Ca/Cr、P/Cr明顯升高(P<0.01)，尿DPD明顯升

9、高(P<0.05)。說(shuō)明去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠呈現(xiàn)高骨轉(zhuǎn)化率，骨吸收增加，伴隨骨形成代償性增加，骨量減少，預(yù)示骨密度降低，與臨床常見(jiàn)的PMO女性的骨高轉(zhuǎn)換率極相似，提示造模成功。而“雙固一通”針灸治療后，BGP顯著升高，提示成骨細(xì)胞(OB)活性增強(qiáng)，骨形成增加。雙固一通組、中成藥組均可升高血鈣，降低血磷，降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD；常規(guī)組可升高血鈣，降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD，對(duì)于血P無(wú)明顯的降低作用。說(shuō)明中醫(yī)藥治

10、療可以調(diào)節(jié)Ca、P代謝，促進(jìn)骨形成，減緩骨吸收。
　　 2模型組腰椎BMD明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，各治療組腰椎BMD均明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)。與雙固一通組比較，有顯著性差異(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組股骨BMD明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，各治療組股骨BMD均明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與雙固一通組比較，各組無(wú)顯著性差異(P>

11、0.05).
　　 3光鏡觀察結(jié)果顯示：模型組骨小梁稀疏、細(xì)、中斷點(diǎn)多、間距寬，部分區(qū)域出現(xiàn)較大的空白區(qū)域。常規(guī)組、中成藥組、雙固一通組的骨小梁增多、增粗、間隙變窄，中斷點(diǎn)減少，三組間的區(qū)別不明顯。雙固一通的骨小梁排列密集，相互之間的連接明顯增多，寬度增寬，體積增大，間隙變窄。
　　 4模型組血清IL-6明顯升高，E2明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，各治療組血清IL-6均降低，E2明顯升高，有非

12、常顯著性差異(P<0.01)。與中成藥組比較，雙固一通組和常規(guī)組血E2無(wú)顯著性差異(P>0.05)。雙固一通組優(yōu)于常規(guī)組和中成藥組(P<0.01)。在本實(shí)驗(yàn)中模型組E2水平降低，IL-6含量增高，與既往的研究結(jié)果一致?！半p固一通”針灸治療后，大鼠血E2顯著升高、IL-6顯著下降(P<0.05)，雙固一通組優(yōu)于常規(guī)組和中成藥組。表明“雙固一通”針?lè)ㄖ委熌軌蛏叽萍に?，抑制IL-6分泌，抑制OC的活性，促進(jìn)骨的形成。
　　 5模型組

13、血M-CSF明顯升高、OPG明顯降低、RANKL明顯降低、RANK值明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，雙固一通組、常規(guī)組和中成藥組M-CSF明顯降低、OPG值明顯升高、RANK明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，中成藥組血清RANKL升高，常規(guī)組血清RANKL有降低趨勢(shì)，但均無(wú)顯著性差異。雙固一通組優(yōu)于常規(guī)組和中成藥組。說(shuō)明針刺可以通過(guò)提高血OPG、RANKL、RANK的含量，降低M-CSF

14、，從而抑制破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的骨吸收來(lái)減少骨量的丟失，且“雙固一通”針?lè)▋?yōu)于其它方法。
　　 6模型組骨M-CSFmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，各治療組M-CSFmRNA表達(dá)均降低，有非常顯著性差異(P<0.01)。與雙固一通組比較，常規(guī)組M-CSFmRNA表達(dá)升高，有顯著性差異(P<0.05)，中成藥組有非常顯著性差異(P<0.01)。中成藥組、常規(guī)組、雙固一

15、通組均有效，但雙固一通組效最好。
　　 模型組骨OPGmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，各治療組OPGmRNA表達(dá)均升高，有非常顯著性差異(P<0.01)。與中成藥組和常規(guī)組比較，雙固一通組有非常顯著性差異(P<0.01)，與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。中成藥組、常規(guī)組、雙固一通組均有效，但雙固一通組效最好。
　　 模型組骨RANKLmRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，

16、有非常顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，雙固一通組骨RANKLmRNA表達(dá)升高，有非常顯著性差異(P<0.01)，中成藥組和常規(guī)組RANKLmRNA表達(dá)與模型組比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。雙固一通組與中成藥組比有顯著性差異(P<0.05)。雙固一通組有效，中成藥組和常規(guī)組均無(wú)效。
　　 模型組骨OPG/RANKL比值較對(duì)照組顯著降低，有顯著性差異(P<0.05)。與模型組比，雙固一通組骨OPG/RANKL比值升高，有

17、非常顯著性差異(P<0.01)，中成藥組與模型組比有顯著性差異(P<0.05)，常規(guī)組與模型組比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。中成藥組與雙固一通組均有效，但雙固一通組效更好。
　　 本研究結(jié)果表明：模型組骨M-CSFmRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，提示OC生成增加；各治療組M-CSFmRNA表達(dá)均降低(P<0.01)，表明中醫(yī)藥治療尤其是“雙固一通”針?lè)梢砸种芆C數(shù)量，或降低OC活性，減緩骨吸收。模型組骨OPG、RANK

18、LmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，提示OPG蛋白表達(dá)降低，破骨吸收增加；RANKL蛋白表達(dá)降低，OPG與RANKL結(jié)合有一定程度的阻滯OC生成的作用，而綜合作用仍表現(xiàn)為骨吸收的增加。OPG/RANKL比值能反映成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的形成，比值越大，OB介導(dǎo)的能力越強(qiáng)；englixibaoweiia促進(jìn)骨吸收，限制骨礦化的速度。
　　 模型組骨OPG/RANKL比值表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，提示骨形成降低。雙固

19、一通組骨OPG、RANKLmRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)、RANKLmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，OPG/RANKL比值明顯升高(P<0.01)，提示“雙固一通”針?lè)赡芡ㄟ^(guò)促進(jìn)OPG蛋白表達(dá)，提高OB活性，通過(guò)與RANK競(jìng)爭(zhēng)和RANKL的結(jié)合，阻止OC的生成，阻止骨吸收。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)本課題的研究，我們認(rèn)為：“雙固一通”針?lè)▽?duì)OPG/RANKL/RANK的調(diào)節(jié)是多環(huán)節(jié)、多途徑的：
　　 1

20、“雙固一通”針灸治療后，BGP顯著升高，提示成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨形成增加；血鈣升高，血磷降低，尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD降低，提示“雙固一通”針灸治療可以通過(guò)增加胃腸吸收功能，促進(jìn)對(duì)鈣、磷等各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，調(diào)節(jié)Ca、P代謝，降低尿Ⅰ型膠原分解產(chǎn)物DPD濃度，提高BGP濃度，從而抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成，最終使骨礦含量增加，維持甚至提高骨密度。
　　 2“雙固一通”針灸治療能通過(guò)提高去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠E2的水平

21、，減少IL-6含量，加強(qiáng)雌激素對(duì)IL-6的抑制作用，減少OC的前體細(xì)胞形成，抑制骨吸收，表現(xiàn)為BMD的升高、模型大鼠骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善。
　　 3“雙固一通”針灸治療能升高去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF水平，以抑制OC的活性而減少骨吸收，減少骨量的丟失。
　　 4“雙固一通”針灸治療能升高去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF，以抑制O