“雙固一通”針?lè)▽?duì)帕金森病模型大鼠中樞免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 帕金森病(Parkinson's disease，PD)主要以中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性喪失為特征，是一種好發(fā)于中老年人常見(jiàn)的緩慢進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病率在神經(jīng)變性疾病中處于第二位，而且發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸增高，65歲以上的老年人中，發(fā)病率占到1％～3％。當(dāng)紋狀體內(nèi)多巴胺水平減少70％～80％，中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性超過(guò)50％時(shí)，與兒茶酚胺能神經(jīng)遞質(zhì)之間的功能失調(diào)，導(dǎo)致錐體外系運(yùn)動(dòng)功能障礙，如出現(xiàn)靜

2、止性震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)過(guò)緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等表現(xiàn)。 研究顯示，幾乎所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞均有可能參與到發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，但在PD的發(fā)展中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活具有更加重要的意義。首先，氧自由基損傷在多巴胺能神經(jīng)元損傷中具有決定意義，而小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是大量自由基產(chǎn)生的主要來(lái)源，其次，組織學(xué)研究表明中腦黑質(zhì)區(qū)是小膠質(zhì)細(xì)胞最富集的區(qū)域。在PD患者腦脊液中，伴隨著中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元選擇性喪失的是大量表達(dá)人類白細(xì)胞抗原(H

3、LA)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，DA能神經(jīng)元的喪失程度與小膠質(zhì)細(xì)胞激活呈平行關(guān)系。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后所釋放的前炎癥細(xì)胞因子和過(guò)量的自由基介導(dǎo)了DA能神經(jīng)元的損傷，因此只要能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，就能最大限度的減少DA能神經(jīng)元的丟失。 近年來(lái)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法治療PD的研究取得了一定的進(jìn)展，尤其是針灸作為一種獨(dú)特、安全、方便的治療方法已經(jīng)越來(lái)越多地運(yùn)用于臨床，取得了較為肯定的療效。毫針、頭針、電針等常用的針灸法用于帕金森氏病的治療，針灸可以對(duì)

4、肌電位產(chǎn)生影響、調(diào)整抗氧化酶系統(tǒng)，提高腦內(nèi)DA水平及對(duì)免疫因子成分產(chǎn)生影響。但有關(guān)針灸治療PD作用機(jī)制的深入研究甚少。我們?cè)谇捌诠ぷ髦校瑢?dǎo)師王華教授根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論，認(rèn)為肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)是本病的主要病機(jī)，主病在肝，病位在腦，確定了通調(diào)腦絡(luò)，熄風(fēng)止顫，柔肝舒筋的治療原則，根據(jù)“雙固一通”針灸法的指導(dǎo)思想，選取關(guān)元、足三里、太沖、風(fēng)府四穴，對(duì)PD模型大鼠施以電針治療，發(fā)現(xiàn)針刺可使PD大鼠中腦黑質(zhì)TH活性增強(qiáng)，大腦皮質(zhì)一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)降低，

5、紋狀體谷氨酸(Glu)含量下降，膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)表達(dá)增強(qiáng)，并觀察了黑質(zhì)神經(jīng)元的超微病理改變。本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上，建立早中期PD大鼠模型，采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞免疫、體液免疫、免疫調(diào)控等方面入手，在細(xì)胞和分子水平闡明針刺治療對(duì)PD免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為揭示針刺治療PD的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床治療提供指導(dǎo)作用。 方法： 1.建立早中期偏側(cè)PD大鼠模型：SD大鼠40只，

6、隨機(jī)分為4組：正常組，假手術(shù)組，模型組，“雙固一通”組。在腦立體定位儀上，將6-OH DA 15μg(溶于3μl含0.2％維生素C的生理鹽水中)，注入大鼠一側(cè)紋狀體尾殼核，術(shù)后第6周后以阿樸嗎啡(apomorphine，APO)腹腔注射(0.5mg/kg)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，40min內(nèi)平均轉(zhuǎn)速超過(guò)7r/min者為造模成功。 2.“雙固一通”針刺治療方法：取關(guān)元、足三里、太沖、風(fēng)府，28號(hào)1寸毫針針刺，接G6805A型電針治療儀，采用

7、斷續(xù)波，頻率為2Hz，每天1次，每次30分鐘，連續(xù)治療2周后取材。 3.“雙固一通”針?lè)▽?duì)PD模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元含量的影響：以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞和纖維的形態(tài)及數(shù)量。 4.“雙固一通”針?lè)▽?duì)PD模型大鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞含量的影響：采用蓖麻凝集素標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。 5.“雙固一通”針?lè)▽?duì)PD模型大鼠黑質(zhì)TNF-α和IL-1β含量的影響：運(yùn)用抗細(xì)胞因子單克隆抗體測(cè)定法測(cè)定TNF

8、-α含量，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)IL-1β。 6.“雙固一通”針?lè)▽?duì)PD模型大鼠黑質(zhì)補(bǔ)體C1q和C9水平的影響，采用采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)。 7.“雙固一通”針?lè)▽?duì)PD模型大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響：rt-PCR方法檢測(cè)Bcl-2 mRNA基因表達(dá)。 結(jié)果： 1.模型組損毀側(cè)黑質(zhì)致密部神經(jīng)元總數(shù)、TH陽(yáng)性神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)量顯著低于正常組和假手術(shù)組(P<0.01)，“雙固一

9、通”組與模型組比較各相應(yīng)指標(biāo)數(shù)值顯著增加(P<0.01)； 2.正常組和假手術(shù)組幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，而雙固一通組的黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與模型組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相比降低(P<0.05)； 3.與模型組、正常組和假手術(shù)組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質(zhì)TNF-α和IL-1 β含量明顯降低(P<0.01)； 4.與模型組，正常組和假手術(shù)組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質(zhì)補(bǔ)體C1q和C9含量明顯降低(P<0.01.)；

10、 5與對(duì)照組相比，Bcl-2 mRNA在模型組的黑質(zhì)內(nèi)表達(dá)活性有所下降，“雙固一通”組Bcl-2 mRNA的表達(dá)增高，與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1.“雙固一通”針?lè)梢蕴岣呱窠?jīng)元總數(shù)、TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量，阻止神經(jīng)元進(jìn)一步損傷； 2.“雙固一通”針?lè)梢砸种芇D大鼠黑質(zhì)異常增多的陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量； 3.PD大鼠TNF-α和IL-1β含量過(guò)高，“雙固一通”針?lè)芙档投吆浚瑴p少對(duì)