羥基磷灰石涂層硅橡膠生物安全性評價及細胞相容性提高的分子機制.pdf

1、背景與目的:
　　在人體組織器官缺損修復(fù)中，生物材料的應(yīng)用越來越廣泛。這類材料用于修復(fù)或替代病損組織器官并恢復(fù)其功能，且對人體無明顯不良影響。生物相容性是材料在臨床應(yīng)用的重要制約因素，David Williams對人體植入材料的生物相容性定義如下：既能達到預(yù)期的既定目標，又不引起任何預(yù)期之外的局部或全身反應(yīng)的性能。在整形外科領(lǐng)域，生物材料往往用做填充材料，主要分為天然來源生物材料和人工生物材料兩種。人工生物材料又包括金屬材料，無機

2、非金屬材料以及高分子材料。
　　羥基磷灰石是六方磷灰石系列的一種，它具有優(yōu)良的生物相容性，無毒、無刺激性、無排斥反應(yīng)、不老化、不致敏、不致癌。同時羥基磷灰石有很好的骨傳導(dǎo)性，HA于骨之間結(jié)合牢固，與骨組織能達到較理想的生物結(jié)合。但是它脆性較高，難以雕刻成形。
　　本課題組結(jié)合兩種材料的優(yōu)點，避開兩種材料的缺點揚長避短，前期成功制備羥基磷灰石涂層硅橡膠，并對其進行理化性能檢測和初步的細胞相容性檢測，發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石涂層硅橡膠材料

3、理化性能良好，并可以改善硅橡膠表面細胞相容性較差的缺陷。本課題將在前期研究的基礎(chǔ)上對制備好的羥基磷灰石涂層硅橡膠材料的細胞相容性進行進一步的評價，并采用體內(nèi)植入實驗研究材料的生物相容性，同時對材料的生物安全性進行檢測，進一步研究在材料一細胞界面中細胞和材料之間相容性的具體影響因素，探索在羥基磷灰石涂層硅橡膠表面細胞相容性較普通硅橡膠提高的可能分子機制。
　　方法:
　　本課題實驗分四部分
　　第一部分:HA/SR的生物

4、相容性檢測和生物安全性評價
　　1、材料的生物相容性檢測
　　將羥基磷灰石涂層硅橡膠以及普通硅橡膠表面培養(yǎng)的細胞通過細胞骨架染色，CCK8檢測，掃描電鏡觀察以及材料表面細胞粘附相關(guān)分子包括vinculin、zyxin、talin等的分子檢測進一步研究材料表面的細胞相容性，通過體內(nèi)植入實驗進一步研究材料的生物相容性。
　　2、材料的生物安全性評價
　　通過材料溶血率測定，試驗動物體重、肝腎功能、臟器表面觀察，植入實

5、驗及HE染色、Masson染色、免疫組化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激實驗，過敏試驗和致熱源實驗研究材料毒理學(xué)性能和生物安全性。
　　第二部分:OPN在材料表面的吸附情況研究:
　　1、大鼠創(chuàng)面滲出液處理的材料表面蛋白吸附:
　　通過收集大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料后進行材料表面普通光鏡觀察、掃描電鏡觀察，和測定材料表面水接觸角分析大鼠創(chuàng)面滲出液

6、浸泡處理后材料的性能變化，WB驗證材料表面吸附的OPN蛋白情況。
　　2、材料表面粘附細胞OPN的表達和分泌情況
　　SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料表面體外培養(yǎng)人真皮成纖維細胞，收集培養(yǎng)上清，提取細胞總蛋白，WB實驗驗證材料表面粘附細胞OPN的分泌以及表達情況。
　　第三部分:OPN在HA/SR表面細胞粘附中的重要橋梁作用研究
　　1、OPN對材料表面培養(yǎng)細胞粘附的影響
　　分別在SR、HA-

7、1/SR、HA-2/SR三種材料表面培養(yǎng)人真皮成纖維細胞，同時分別在每組材料培養(yǎng)的細胞體系中加入外源性重組人OPN蛋白和OPN抗體，觀察每組細胞的粘附情況。
　　2、OPN在細胞遷移中的作用
　　利用外源性O(shè)PN蛋白作為細胞趨化劑，采用Trans well細胞趨化實驗驗證OPN在細胞遷移中的作用。結(jié)合OPN對材料表面培養(yǎng)的細胞粘附情況共同揭示OPN蛋白在羥基磷灰石涂層硅橡膠材料表面的細胞粘附和遷移的重要作用。
　　第四

8、部分:HA/SR細胞相容性提高的分子機制研究
　　1、通過RNA干擾技術(shù)降低MMP9的表達，了解OPN和MMP9的關(guān)系。采用質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)手段探索OPN和MMP9是通過哪種具體分子機制調(diào)控材料表面細胞骨架重排，介導(dǎo)羥基磷灰石涂層硅橡膠生物相容性的改變。
　　2、在SR、HA-1/SR、HA-2/SR三種材料表面體外培養(yǎng)人真皮成纖維細胞，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE分離，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，分析并切取差異點

9、蛋白酶解后行質(zhì)譜分析，在EMBL，NCBI等數(shù)據(jù)庫分析質(zhì)譜結(jié)果，分析可能的分子機制并采用WB回復(fù)驗證。
　　結(jié)果:
　　1、HA/SR的生物相容檢測
　　(1)將羥基磷灰石涂層硅橡膠以及普通硅橡膠表面培養(yǎng)的細胞通過細胞骨架染色，CCK8檢測，掃描電鏡觀察，明確HA/SR表面具有較好的細胞相容性可以顯著提高材料表面的細胞粘附和增殖。
　　(2)通過對材料表面細胞粘附相關(guān)分子包括vinculin、zyxin、tali

10、n等的分子檢測進一步研究材料表面的細胞相容性，揭示羥基磷灰石涂層硅橡膠確實可以提高材料表面細胞粘附分子的表達，即提高SR表面的細胞粘附能力。
　　(3)通過將材料在大鼠體內(nèi)植入7天，30天，90天，180天后取出，對材料周圍組織HE染色發(fā)現(xiàn)組織生長狀態(tài)良好，實驗進一步證實了HA/SR材料的生物相容性。
　　2、HA/SR的毒理學(xué)性能檢測及生物安全性評價
　　通過材料溶血率測定，試驗動物體重、肝腎功能、臟器表面觀察，植入

11、實驗及材料周圍組織HE染色、Masson染色、免疫組化染色(CD4、CD68、TNF-a、a-SMA、elastin)，刺激實驗，過敏試驗和致熱源實驗研究材料毒理學(xué)性能和生物安全性，實驗結(jié)果表明HA/SR安全無毒副作用，符合國家生物材料安全性的相關(guān)標準。
　　3、OPN蛋白在HA/SA表面的吸附情況
　　(1)通過對大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡的材料表面外表觀察、掃描電鏡分析以及水接觸角分析，我們發(fā)現(xiàn)大鼠創(chuàng)面滲出液浸泡的材料表面水接觸

12、角下降了，這可能與材料表面吸附有某種親水性蛋白質(zhì)有關(guān)。
　　(2)通過對HA/SR以及SR表面細胞的粘附蛋白質(zhì)層進行WB驗證，證明材料表面確實有OPN蛋白的吸附，同時，OPN蛋白在HA/SR表面的吸附量比SR表面吸附量更大，這可能與HA/SR較SR表面細胞相容性更佳有關(guān)。
　　(3)通過對材料表面粘附細胞外分泌的OPN蛋白以及細胞內(nèi)的OPN蛋白進行半定量分析，證明在HA/SR表面粘附細胞分泌的OPN蛋白以及細胞內(nèi)OPN蛋白的

13、表達都較SR表面細胞高，進一步說明OPN在材料表面的吸附可能與HA/SR材料的細胞相容性提高有重要關(guān)系。
　　4、OPN在HA/SR表面細胞粘附中的橋梁蛋白作用
　　(1)通過外源性O(shè)PN的加入和OPN的抗體阻斷實驗可以看出:在HA/SR以及SR表面，外源性O(shè)PN的加入可以使得材料表面細胞的粘附增強，而當(dāng)OPN抗體的加入使的材料表面OPN的結(jié)合減弱時，材料表面細胞粘附同時減弱，這一結(jié)果表明在HA/SR表面細胞相容性的提高和O

14、PN存在著重要的正向相關(guān)性。
　　(2)通過Trans Well實驗，OPN作為外源性蛋白加入細胞趨化小室外室可以顯著提高成纖維細胞的穿膜能力揭示了OPN可能在材料/細胞界面提高細胞的遷移能力相關(guān)。通過對材料的表面蛋白質(zhì)層的吸附分析以及采用外源性O(shè)PN蛋白的加入和OPN抗體的阻斷，采用WB，Transwell等實驗技術(shù)手段明確OPN在材料/細胞界面的重要作用，揭示OPN蛋白在羥基磷灰石涂層硅橡膠材料表面的細胞粘附和遷移中發(fā)揮著重要

15、作用。
　　5、HA/SR細胞相容性提高的分子機制
　　(1)HA/SR材料表面MMP9的活性較SR表面顯著增加，這表明隨著羥基磷灰石在SR表面涂層，MMP9的活性增強了，這一點和HA/SR表面OPN的分泌趨勢一致，這也表明MMP9可能和OPN存在某種正向相關(guān)性。
　　(2)MMP9干擾后材料表面細胞的粘附數(shù)量減少，細胞形態(tài)也呈現(xiàn)比較凌亂的狀態(tài)，細胞骨架成皺縮，固著狀態(tài)，但是這一形態(tài)的改變和粘附數(shù)量的減少可以為OPN所

16、逆轉(zhuǎn)，表明MMP9是OPN的下游分子參與細胞粘附，提高材料表面的相容性。
　　(3)通過質(zhì)譜結(jié)果分析并通過NCBI數(shù)據(jù)庫和EMBL數(shù)據(jù)庫，找出主要差異點蛋白通過文獻檢索和分析我們提出可能是EF1β介導(dǎo)的γ-actin導(dǎo)致細胞骨架重排，從而影響材料表面細胞相容性，同時這一猜想被EF1β干擾致材料表面細胞粘附減弱這一實驗現(xiàn)象所證實。
　　結(jié)論:
　　1、HA/SR具有良好的生物相容性。
　　2、HA/SR安全無毒，符