Fe3O4納米顆粒對(duì)細(xì)胞低溫保存過程傳遞現(xiàn)象的影響及其應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞、組織或者器官可以在低溫下長期保存，但卻極易在添加/去除低溫保護(hù)劑、降溫以及復(fù)溫過程中遭受損傷而導(dǎo)致死亡。細(xì)胞在冷凍過程中遭受的低溫?fù)p傷主要是滲透壓超過細(xì)胞承受范圍導(dǎo)致的溶液損傷和細(xì)胞內(nèi)外溶液中冰晶的形成和生長、冰晶再結(jié)晶、玻璃化與反玻璃化等胞內(nèi)冰損傷。納米材料由于具有優(yōu)良的導(dǎo)熱性，抑制冰晶的形成和生長、增強(qiáng)降溫速率、促進(jìn)溶液玻璃化的轉(zhuǎn)變等特性，可以應(yīng)用于低溫保存中降低低溫?fù)p傷。我們研究了Fe3O4納米顆粒對(duì)于低溫保護(hù)劑添加/去除過

2、程以及冷凍過程中傳遞現(xiàn)象的影響，并且利用Fe3O4納米顆粒的電磁感應(yīng)加熱輔助玻璃化凍存的復(fù)溫。
　　本文首先設(shè)計(jì)并改進(jìn)了微灌流腔系統(tǒng)，開發(fā)了一種更簡便易用的微灌流顯微鏡裝置用以測量細(xì)胞膜的滲透性參數(shù)。并且測定豬脂肪干細(xì)胞(pADSC)在不同溫度下高滲磷酸鹽緩沖鹽水以及低溫保護(hù)劑中細(xì)胞滲透響應(yīng)過程，使用2-p模型擬合得到pADSCs的滲透系數(shù)。我們測定pADSCs的非滲透性體積（Vb），以及在不同溫度下水的滲透系數(shù)（Lp），和CPA

3、滲透率（Ps），然后定量分析溫度對(duì)pADSC膜的傳輸性質(zhì)的影響。根據(jù)得到的滲透參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化CPA添加/去除過程，以降低低溫保存過程中細(xì)胞的過度收縮造成的損傷。并且我們使用微灌流顯微鏡系統(tǒng)測定了Sf21細(xì)胞在25，15，5和-2℃下滲透響應(yīng)過程，分別使用兩者的K-K模型和2-p模型擬合體積變化過程，并比較了兩種模型擬合的結(jié)果。本文以Sf21細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)Lp滲透系數(shù)在參考溫度的數(shù)值(Lpg)與CPA的摩爾濃度線性，由此我們得到Sf21細(xì)

4、胞膜的滲透系數(shù)對(duì)于溫度和低溫保護(hù)劑具有雙重依賴的特定，并拓展了Arrhenius關(guān)系，最終結(jié)果驗(yàn)證了拓展后Arrhenius公式與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常符合。此后，我們測定了Fe3O4納米顆粒對(duì)于細(xì)胞膜的滲透系數(shù)影響，使用微灌流腔系統(tǒng)測量了在25，15，5和-2℃下不同濃度氧化鐵納米顆粒對(duì)Sf21細(xì)胞滲透響應(yīng)的影響，并且使用2-p模型擬合了相應(yīng)的體積變化過程，得到細(xì)胞膜的滲透參數(shù)。通過測量不同濃度氧化鐵納米顆粒對(duì)Sf21細(xì)胞滲透參數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)氧

5、化鐵納米顆粒明顯改變細(xì)胞膜對(duì)于水的滲透參數(shù)。這些結(jié)果表明納米顆粒加入后，Lp對(duì)于溫度的敏感性顯著降低，而納米濃度的增加沒有對(duì)Lp的溫度敏感性產(chǎn)生很大的影響。同時(shí)，納米顆粒的加入顯著增加了Lpg，說明在0℃下Lp數(shù)值明顯增加，而隨著納米顆粒濃度的增加，在0℃下Lp數(shù)值沒有明顯增加。
　　為了研究Fe3O4納米顆粒對(duì)低溫冷凍中水輸運(yùn)和胞內(nèi)冰形成的影響，通過低溫顯微鏡我們測試了納米顆粒對(duì)水輸運(yùn)和胞內(nèi)冰形成的影響。定量分析了人臍帶血內(nèi)皮細(xì)

6、胞（HUVECs）對(duì)Fe3O4納米顆粒的攝入，并且使用透射電子顯微鏡(TEM)確定納米顆粒進(jìn)入HUVECs細(xì)胞內(nèi)。利用低溫顯微鏡測定了在不同的冷卻速度下HUVECs細(xì)胞的水輸運(yùn)和胞內(nèi)冰現(xiàn)象，并通過水輸運(yùn)模型和胞內(nèi)冰概率模型，擬合得到水滲透參數(shù)(Lpg，ELp)和胞內(nèi)冰的形成概率參數(shù)(Ω2，κ)。定量分析了Fe3O4納米顆粒在細(xì)胞外溶液中和在細(xì)胞內(nèi)對(duì)水的滲透性和細(xì)胞內(nèi)冰形成的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4納米顆粒改善了凍結(jié)過程中水的運(yùn)輸，并且

7、促進(jìn)胞內(nèi)冰的形成。這些重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為HUVEC納米冷凍保存提供了基礎(chǔ)。
　　為了解決復(fù)溫過程中遇到的復(fù)溫速率慢和溫度不均勻等問題，我們探索了利用超順磁性納米顆粒的電磁感應(yīng)加熱作用輔助復(fù)溫玻璃化冷凍的生物樣品。我們使用共沉淀法合成了超順磁性Fe3O4納米顆粒并且對(duì)其進(jìn)行表征，研究了Fe3O4納米顆粒對(duì)于細(xì)胞玻璃化凍存的作用，并且使用電磁感應(yīng)加熱復(fù)溫玻璃化冷凍的生物樣品，優(yōu)化了復(fù)溫的條件并系統(tǒng)測定了復(fù)溫后生物樣品的存活率和生物功能等

8、重要的指標(biāo)。我們檢測了超順磁性Fe3O4納米顆粒的細(xì)胞攝入以及對(duì)人臍帶血干細(xì)胞(hUCM-MSC)增值的影響。結(jié)果表明，超順磁性Fe3O4納米顆?？梢赃M(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，并且少量的Fe3O4納米顆粒對(duì)hUCM-MSC細(xì)胞增值沒有影響。并且我們研究了超順磁性Fe3O4納米顆粒對(duì)低溫冷凍保護(hù)液的玻璃化狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)沒有電磁加熱的Fe3O4納米顆粒對(duì)hUCM-MSC的玻璃化冷凍保存過程中沒有顯著影響，而復(fù)溫過程中通過交變磁場加熱Fe3O4納米顆粒