兩個與抗病、抗逆和發(fā)育相關的擬南芥激發(fā)標簽突變體asr1和dai1的研究.pdf

1、植物的生長發(fā)育與其所處的環(huán)境息息相關,在各種環(huán)境因素中,逆境對植物的影響尤為重要.逆境通常包括生物逆境和非生物逆境,前者是指病原微生物、昆蟲以及雜草等對植物的危害,后者是指高鹽、干旱、澇害、低溫和高溫等對植物的影響,兩者相加是造成世界上主要經濟作物產量損失的主要因素.因此,在分子水平上研究植物對生物脅迫和非生物脅迫的適應機制不僅有著重要的理論意義,而且還具有重大的經濟價值.激發(fā)標簽技術是建立在功能獲得突變基礎之上的一項突變體庫構建技術,

2、它在分離和研究基因家族的基因、性狀不易檢測的基因以及性狀由QTL(Quantitativetraitloci)控制的基因等方面具有獨特的優(yōu)勢.此外,激發(fā)標簽技術得到的突變體通常為顯性遺傳,其表型可在轉基因的T<,1>代表現(xiàn)出來,為目的突變體的篩選帶來了很大的便利.因此,利用激發(fā)標簽技術構建模式植物擬南芥的突變體庫,從中篩選與逆境脅迫相關的突變體,克隆并研究相關基因的功能具有很大的成功可能性和良好的應用前景.該文以擬南芥(Arabidop

3、sisthaliana)為實驗材料,以激發(fā)標簽為技術平臺,構建了擬南芥的功能獲得突變體庫,從中篩選具有抗病、抗逆表型的突變體,克隆基因并進行基因的功能研究,取得的主要結果如下:(1)利用含激發(fā)標簽質粒pSKI015的農桿菌直接轉化擬南芥植株,以抗除草劑的Bar基因為篩選標記,獲得了約有12 000個獨立轉化株系的突變體庫,并從中篩選到2個與抗病、抗逆和發(fā)育相關的突變體asr1(auxin and salicylic acid respo

4、nsive 1)和dail(droughttolerant and abscisic acid insensitive 1).(2)通過質粒拯救克隆到了ASR1基因,并在野生型擬南芥Col-0中進行了轉基因驗證.ASR1屬于生長素相關的GH3基因家族,它編碼的蛋白質在突變體內過量表達,并造成植株矮化,蓮座葉片向下卷曲,側根發(fā)生受到抑制等形態(tài)表型的改變,同時,ASR1可能還參與了植物體對抗病信號分子水楊酸的調控或修飾過程,并使asrl突變

5、體對病原菌丁香假單胞桿菌的侵染更敏感.(3)構建了ASR1的原核表達載體并在大腸桿菌中進行了高效表達,得到了相應的多克隆抗體.Western雜交的結果表明,與野生型相比,ASR1基因不僅在轉錄水平上超表達,而且在翻譯的水平上也超表達,并且純合子的表達豐度高于雜合子.此外,還構建了ASR1與GFP(綠色熒光蛋白)融合蛋白的表達載體pCAM-ASR1-GFP,洋蔥表皮瞬時表達系統(tǒng)顯示ASR1:GFP融合蛋白主要定位于細胞壁中.(4)對dai