豬場廢棄物堆肥微生物多樣性及空間異質(zhì)性的研究.pdf

1、規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展為豐富居民菜籃子工程作出了重大貢獻，同時規(guī)?；B(yǎng)豬場糞便的大量集中排放給環(huán)境造成了巨大壓力。堆肥技術起源較早，通常用于有機固體廢棄物的資源化利用，是實現(xiàn)養(yǎng)豬業(yè)與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展的有效途徑之一。堆肥的實質(zhì)是微生物的代謝作用。而且，堆肥微生物多樣性的研究是近年來的熱點。研究表明，當前采用的強制通風好氧堆肥系統(tǒng)會導致物料中存在“梯度效應”，但是其產(chǎn)生的微生物學機理還不得而知。由于溫度是控制微生物群落結構組成的關鍵因素之一，因

2、此，在“梯度效應”存在的情況下微生物的空間分布應具有異質(zhì)性。因而，本研究應用16SrRNA基因作為分子標記，對豬糞堆肥過程中升溫期、高溫期和降溫期的上、中、下三層共9個堆肥樣品中的細菌群落組成及多樣性進行了深入研究，并采用變性梯度凝膠技術對9個堆肥樣品的細菌區(qū)系變化進行了檢測。具體結果如下：1．堆肥試驗
　　 利用強制通風靜態(tài)倉堆肥系統(tǒng)進行了豬場廢棄物堆肥試驗，物料碳氮比調(diào)整為20，起始含水率為65％，堆肥過程歷經(jīng)快速升溫期、持

3、續(xù)高溫期和降溫期三個典型階段，堆制結束時，堆體體積減少了41.67%。堆體溫度在40h達到50℃，并在60℃以上維持10d，蛔蟲卵殺滅率和大腸桿菌值分別為100%和0.062，達到國家糞便無害化衛(wèi)生標準的必要條件。整個堆肥過程歷時53d。堆肥試驗取得成功，為后續(xù)研究工作奠定了基礎。2．核酸的提取
　　 參照Holben(1994)提供的改良方法，對堆肥過程中升溫期、高溫期和降溫期上、中、下三層共9個堆肥樣品進行了微生物的分離、細

4、胞破碎和基因組DNA的提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測片斷大小在15Kb以上。采用DNA/RNA濃度測定儀，測得的A260/A280的比值在1.6-1.8之間，濃度為350ng/μL左右。結果表明，采用本方法提取、純化獲得的核酸結果較好，能夠滿足后面的PCR、克隆等分子生物學研究的需要。
　　 3．基于16SrRNA分子標記的分子生物學分析
　　 (1)將測序結果運用Clustalw程序進行序列比對，堆肥升溫期的上、中、下三層分

5、別被分為33、56和32個序列型；高溫期的上、中、下三層分別被分為48、46和44個序列型；降溫期的上、中、下三層分別被分為48、26和35個序列型。
　　 (2)溫度是影響堆肥微生物群落結構組成的關鍵因素之一。
　　 (3)整個堆肥過程中，在有效分析的1158個克隆子中，總共有357個序列型，約87.4%的序列型歸到Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria(包括α-Proteoba

6、cteria、B-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和δ-Proteobacteria)、Actinobacteria這4個類群中，相應克隆子所占的比例分別是70.6%、1.47%、15.11%、3.80%。另外占全部克隆子數(shù)約9%的44個序列型則和Genbank數(shù)據(jù)庫中的純培養(yǎng)菌無任何相似性。
　　 (4)堆肥初期Shigella、Clostridium等占優(yōu)勢；高溫期Bacillus、Clostr

7、idium、Ureibacillus thermosphaericus等占優(yōu)勢；降溫期Thermobifida fusca、Clostridium等占優(yōu)勢；而在整個堆肥化過程中Clostr idium都是優(yōu)勢菌屬。
　　 (5)發(fā)現(xiàn)了44條未培養(yǎng)菌的序列，與已知菌的序列無任何相似性，但和GenBank中的已知序列有高度相似性。而這些新的序列或可能是新的物種，它們在堆肥過程中究竟起到什么作用，都是值得我們進一步研究的問題，它們在不

8、久的將來很可能成為人類可開發(fā)和可利用的堆肥微生物資源。我們所獲得的這些新序列填補了國內(nèi)這方面的不足，為相關領域的研究者提供了寶貴的科研資料。
　　 (6)獲得了368條堆肥微生物的16S rDNA序列，并提交到了歐洲核酸序列數(shù)據(jù)庫（European Molecular Biology Laboratory, EMBL），獲得登陸號：AM182993-AM183113, AM500715-AM500852, AM930270-AM

9、930378。4．PCR-DGGE分析
　　 (1)PCR-DGGE分析結果顯示，豬場廢棄物堆肥過程中不同時期、不同高度層樣品中有著比較豐富的細菌多樣性，同時存在明顯的優(yōu)勢種群結構變化。PCR-DGGE圖譜中主要的優(yōu)勢性條帶都達到或接近10條以上，加上微弱的條帶會更多，表明豬場廢棄物堆肥過程中如此豐富的微生物是潛在的寶貴資源。
　　 (2)通過Cs值分析結果顯示，整個降溫期3個樣品之間的相似性相對更高些，說明降溫期3層樣