多環(huán)芳烴污染對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌分布及相關(guān)降解基因多樣性的影響.pdf

1、多環(huán)芳烴（PAHs）是一類在環(huán)境中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物，其在土壤中易持留、難降解，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品安全，可通過(guò)食物鏈危害人群健康和生態(tài)安全。能否利用植物內(nèi)生細(xì)菌來(lái)調(diào)控植物體內(nèi)PAHs的代謝，進(jìn)而規(guī)避植物有機(jī)污染風(fēng)險(xiǎn)、保障農(nóng)產(chǎn)品安全？這一問(wèn)題已引起學(xué)者廣泛關(guān)注。了解污染區(qū)植物內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其與污染物降解相關(guān)基因的多樣性，這對(duì)于篩選出具有污染物降解功能的內(nèi)生細(xì)菌、更加有效地利用內(nèi)生細(xì)菌來(lái)消除植物污染風(fēng)險(xiǎn)等具有重要意義。然而遺憾的是

2、，國(guó)內(nèi)外迄今有關(guān)PAHs污染下植物內(nèi)生細(xì)菌的種群和群落結(jié)構(gòu)以及內(nèi)生細(xì)菌中與PAHs降解相關(guān)基因的研究仍幾近空白。
　　本研究采集了長(zhǎng)期在PAHs污染區(qū)生長(zhǎng)、距污染源不同距離且長(zhǎng)勢(shì)較為一致的兩種常見(jiàn)植物一看麥娘和酢漿草，采用有機(jī)溶劑萃取法、高效液相色譜分析法(HPLC)、微生物學(xué)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）分析技術(shù)，研究了不同PAHs污染強(qiáng)度下兩種植物體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌的種群特性、群落結(jié)構(gòu)分

3、布及變化趨勢(shì);分析了植物體內(nèi)與PAHs代謝相關(guān)基因的分布及多樣性;驗(yàn)證了分離出的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)PAHs的耐受性。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)傳統(tǒng)的涂布平板法，研究了不同PAHs污染區(qū)域兩種植物體內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種群及數(shù)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PAHs污染場(chǎng)地中生長(zhǎng)的兩種植物體內(nèi)均存在有數(shù)量可觀的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，但其種群多樣性并不高，同時(shí)PAHs污染水平可顯著影響可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及種群特征。不同PAHs污染區(qū)兩種植

4、物體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量為104到107 CFU·g-1（鮮重），隨著污染程度的增強(qiáng)，其數(shù)量不斷減少。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征分析及16S rRNA基因序列同源性鑒定，從兩種植物體內(nèi)共分離出68株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于14個(gè)屬，5個(gè)綱，3個(gè)門(mén)(Firmicutes、Proteobacteria及Bacteroidetes)。隨著PAHs濃度的變化，各種屬內(nèi)生細(xì)菌所占比例有所不同，但Bacillus spp.和Pseudomonas spp

5、.在不同程度的PAHs污染下均為兩種植物體內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群。對(duì)分離出的68株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行PAH耐受性驗(yàn)證，結(jié)果表明，大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)不同PAHs具有一定的耐受性，部分內(nèi)生細(xì)菌可利用供試的PAH為唯一碳源或能源進(jìn)行生長(zhǎng)。
　　(2)提取供試植物中內(nèi)生細(xì)菌的總DNA，采用PCR-DGGE技術(shù)揭示了PAHs污染區(qū)不同植物組織中內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性的動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)取決于植物類型、植物組織以及土壤和

6、植物中PAHs的含量。不同污染區(qū)、不同植物組織中內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群不盡相同，一般來(lái)說(shuō)中低水平PAHs污染條件下植物內(nèi)生細(xì)菌具有較高的多樣性，且根組織中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性要高于莖葉組織。如低污染區(qū)看麥娘根中內(nèi)生細(xì)菌的香農(nóng)-威爾指數(shù)(Shannon-Wiener Index)為3.38，而高污染區(qū)看麥娘莖葉中內(nèi)生細(xì)菌的香農(nóng)-威爾指數(shù)僅為2.74。實(shí)驗(yàn)從兩種植物內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)的DGGE凝膠中分離、鑒定出77條序列，其中大部分

7、屬于不可培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured bacteria)。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析可得，這77條序列分別屬于4個(gè)門(mén):Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes。數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，不論在何種PAHs污染條件下，Proteobacteria均為兩種供試植物體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。
　　(3)選用萘雙加氧酶(NAH)基因和苯酚單加氧酶(PHE)基因這兩種與植物體內(nèi)PAHs代謝密切相關(guān)的