印度洋深海多環(huán)芳烴降解菌的多樣性分析及降解菌新種的分類鑒定與降解機(jī)理初步研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(polyaromatic hydrocarbons，PAHs)是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的烴類，在環(huán)境中持久存在，具有廣泛的毒性、致突變性、致癌性。探索PAHs在環(huán)境中的歸宿問題，已發(fā)展成為當(dāng)今環(huán)境科學(xué)研究的前沿課題之一。生物，尤其細(xì)菌是去除環(huán)境中PAHs的主力軍。而深海環(huán)境中與PAHs等有機(jī)污染物降解有關(guān)的細(xì)菌還很大程度上不為人知。尋找高效的PAHs降解細(xì)菌，研究其降解基因，探索其代謝途徑，能更加有效的將降解菌應(yīng)用于生

2、物修復(fù)。 本論文主要對(duì)印度洋西南洋中脊深海環(huán)境中PAHs降解菌的多樣性和重要的PAHs降解菌進(jìn)行了研究。采集了西南印度洋中脊熱液區(qū)附近1個(gè)水柱(DY10517A IR-CTD5)的9個(gè)深海水層海水樣品用混合PAHs(菲、芘、熒蒽、蒽)和單一PAH為碳源進(jìn)行富集篩選，得到了9個(gè)混合PAHs降解菌群和9個(gè)菲降解菌群。采用DGGE和單菌分離培養(yǎng)相結(jié)合的方法對(duì)菌群多樣性及菌群富集過程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析。同時(shí)對(duì)2株重要的PAHs降解新菌

3、進(jìn)行了分類鑒定、基因組學(xué)和代謝組學(xué)方面較為系統(tǒng)的研究，探討其降解特性，分析了相關(guān)功能基因，推測(cè)出了可能的代謝途徑。獲得的主要結(jié)果如下： 1.用混合PAHs和單一菲作為碳源，富集印度洋深海海水樣品，獲得了高效的PAHs降解菌群和菲降解菌群。采用平板分離法，在9個(gè)混合PAHs降解菌群中分離到29個(gè)不同的屬的168株可培養(yǎng)細(xì)菌?？膳囵B(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，它們分別屬于6個(gè)大類，其中主要是變形菌綱α亞群(62％)和γ亞群(23％)細(xì)菌

4、，其它4類分別為變形菌綱β亞群(3％)、高G+C革蘭氏陽性菌類群(3％)、CFB類群(6％)和低G+C革蘭氏陽性菌類群(3％)。其中α亞群包含29個(gè)屬中的18個(gè)屬，種屬多樣性十分的豐富。單菌降解實(shí)驗(yàn)表明，分離獲得的大多數(shù)菌株都能利用PAHs進(jìn)行生長(zhǎng)。其中Alterierythrobacter，Bacillus、Citricella、Idiomarina、Lutibacterium、Maricaulis、Thalassospira、Mar

5、telella、Pseudidiomarina，Roseovarius、Salipiger等菌屬未有過PAHs降解的相關(guān)報(bào)道。 2.采用PCR-DGGE法對(duì)PAHs降解菌群和菲降解菌群跟蹤分析了PAHs降解菌群和菲降解菌群中優(yōu)勢(shì)菌的形成過程和菌群的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化。分析結(jié)果表明，雖然不同水層和不同時(shí)期的菌群有所不同。但與新鞘氨醇桿菌、食烷菌、節(jié)桿菌、巴爾通氏體菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌屬近緣的菌株是菌群中

6、最常見的優(yōu)勢(shì)菌或較優(yōu)勢(shì)的菌。其中巴爾通氏體菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌屬還沒有降解PAHs的相關(guān)報(bào)道，可能是潛在的海洋PAHs降解菌。動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，第8d是混合PAHs降解菌群富集過程中的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)菌群結(jié)構(gòu)變化較明顯。此時(shí)菌群中對(duì)PAHs的代謝可能已經(jīng)由菲轉(zhuǎn)到對(duì)其他PAHs的降解。相比之下，菲的降解菌群在4d時(shí)趨近穩(wěn)定，此后菌群結(jié)構(gòu)沒有非常明顯的變化。 3.從DY10517A IR-CTD5站位的深

7、海水樣中分離了一株高效的PAHs降解菌H25，其16S rRNA基因與新鞘氨醇桿菌屬的Novosphingobium pentaromativorans US6-1T有最高同源性為96.0％。通過生理生化特性、脂肪酸成分的分析，G+Cmol％的測(cè)定和DNA-DNA雜交結(jié)果表明菌株H25為新鞘氨醇桿菌屬的一個(gè)新種，命名為(Novosphingobium indicum)。芳環(huán)羥基化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxy

8、genase，RHDs)是PAHs降解過程中控制苯環(huán)的起始加氧，是微生物降解反應(yīng)的限速步驟。我們通過引物設(shè)計(jì)，從該菌株中擴(kuò)增出了兩條含有PAHs降解起始雙加氧酶大小亞基及其上下游序列的基因片段。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，H25菌株含有至少兩套與芳烴降解有關(guān)的雙加氧酶系統(tǒng)，能較好的利用多種PAHs。這說明在研究不多的未受污染的深海區(qū)域蘊(yùn)藏著許多具有清除有機(jī)污染潛力的菌種，是值得進(jìn)一步探索和研究的新領(lǐng)域。 4.對(duì)本實(shí)驗(yàn)室從西南印度洋中脊沉積物樣品(

9、DY10517A IR-TVG4站點(diǎn))分離到的Pseudoruegeria屬新菌株P(guān)TG4-1進(jìn)行了鑒定。通過16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，生理生化特性的比較，脂肪酸成分的分析及G+Cmol％的測(cè)定，確定該菌株為Pseudoruegeria屬的一個(gè)新種(Pseudoruegeria indicum)。對(duì)該菌株的PAHs降解范圍和降解率進(jìn)行了測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該菌株是一株廣譜、高效的PAHs降解菌，在環(huán)境生物修復(fù)中具有較大的應(yīng)用前景。為