低強度電磁場影響大鼠糖尿病腎病的體內外實驗研究.pdf

1、糖尿病(Diabetes Mellitus,DM）的發(fā)病率與日俱增，而其伴隨的并發(fā)癥對健康也產(chǎn)生了巨大威脅，例如骨質疏松、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)等，據(jù)統(tǒng)計全球大概有20％-40%的I型或II型糖尿病病人會發(fā)展成為DN。DN是慢性腎病死亡的首要原因，它大概占到全世界終末期腎病的50%。DN的典型特征是腎小球對蛋白質的通透性增加以及腎小球系膜細胞（Glomerular Mesangial

2、Cell,GMC）的胞外基質（Extracellular Matrix,ECM）沉積，上述病理改變最終造成腎小球硬化癥以及嚴重的腎臟損傷。由于腎臟移植手術的高額費用，因而全世界與日俱增的DN發(fā)病率是一個非常敏感的普遍問題。高血糖及糖代謝紊亂在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如果導致腎損傷程度達到終末期，其可選擇的治療方法非常有限。目前在臨床上，治療DN主要是通過藥物來控制血糖濃度，以及應用保護腎臟的藥物，來達到聯(lián)合治療的目的。但是，上述藥物對

3、于部分DN患者往往副作用較大、耐藥性差。因而，探求一種既安全又有效的非藥物治療DN的方法配合保護腎臟的藥物來聯(lián)合治療DN顯得非常必要。
　　低強度電磁場（Low-intensity Electromagnetic Fields,LEMFs）作為一種非侵入式治療手段，有促進術后創(chuàng)傷愈合、減輕組織水腫、消炎止痛等效果。糖尿病本身是一種慢性炎癥的病變，能引起系膜區(qū)ECM中間產(chǎn)物的增加并減緩其降解速度，從而形成 ECM沉積進而發(fā)展成為腎小

4、球硬化癥。Norton在1988年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LEMFs有助于降解體外培養(yǎng)的軟骨細胞和皮膚纖維細胞ECM成份。因此，如果LEMFs的干預能有效減少系膜細胞的ECM合成并提高其降解，將有助于對DN患者腎臟的保護。有相關研究報道了波長為670 nm的低強度的光照（一種極高頻的電磁波）可改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導的I型糖尿病大鼠的腎臟功能以及抗氧化的能力。俄羅斯學者曾采用低強度特高頻（300-3000MHz）治療設備，用于治療小兒血糖代謝紊亂

5、引起的腎損傷，并發(fā)現(xiàn)能緩解損傷程度以及阻止新的類脂聚積引起的漸進性壞死的發(fā)生。這些研究雖然能反映出電磁場對糖尿病腎病模型動物和患者都有一些積極的作用，但是缺乏系統(tǒng)的實驗探討其可能的機理，而且這兩個的實驗均采用高頻電磁場，其產(chǎn)生的熱效應也是不可忽視的。除此之外，近幾十年內很少有相關實驗研究能引起國內外學者的廣泛關注。因此，本課題旨在研究LEMFs對于大鼠糖尿病腎病的影響，為防治糖尿病腎病提供新的思路和實驗依據(jù)。全文主要探討了以下三個問題：

6、
　?。?）LEMFs的干預能否影響大鼠DN模型細胞ECM代謝；
　?。?）三種不同波形LEMFs中哪種波形對ECM合成降解及相關信號通路影響最大；
　　（3）LEMFs的干預能否對DN模型大鼠的腎臟起一定保護作用。
　　第一部分研制一種能輸出任意波形的電磁發(fā)生平臺
　　目的：電磁生物效應研究中，最主要的環(huán)節(jié)就是搭建電磁發(fā)生平臺。在長期的研究中，我們基本采用模擬電路搭建平臺，如果需要改變電磁參數(shù)，就需要另外

7、設計電磁發(fā)生裝置，使研究周期大大加長，而且本研究中也涉及多種波形參數(shù)。因此，需要研制一款可以輸出任意波形的低強度電磁發(fā)生平臺。
　　方法：采用虛擬儀器技術、模塊化設計、可編程思路編寫數(shù)字信號發(fā)生軟件，實現(xiàn)了數(shù)字信號輸出，通過D/A采集卡轉換成模擬信號，再進行功率放大，最后線圈負載輸出。
　　結果：該平臺只需要重新編寫軟件的“波形模塊”部分，就能得到需要的參數(shù)，理論上能夠輸出任意波形的LEMFs。
　　結論：該平臺可方便

8、輸出不同波形并確保其一致性，使實驗設計更加科學，有利于優(yōu)化電磁參數(shù)。
　　第二部分研究不同波形LEMFs對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞株（HBZY-1）ECM代謝的影響
　　目的：LEMFs參數(shù)多樣，無法一一進行研究，在初步的細胞實驗中，我們選擇三種在電磁非熱生物效應研究中較為常用的波形參數(shù)。如何解決 ECM異常堆積，是目前研究和治療腎小球硬化癥的主要方向，本部分就是研究 LEMFs對DN模型細胞ECM代謝產(chǎn)物的表達以及參與調節(jié)

9、ECM的主要信號通路是否有積極的影響，并找到三種波形中的最優(yōu)參數(shù)。
　　方法：實驗采用1.6mT、15Hz的正弦、方波、脈沖群分別對高糖培養(yǎng)的HBZY-1細胞株進行干預（8 h/d），連續(xù)3d。完成后采用MTT法檢測細胞活性，ELISA法檢測上清液中TGFβ1、FN、MMP-2蛋白含量，熒光定量PCR檢測TGFβ1、FN、MMP-2 mRNA含量，Western blot法檢測p38MAPK、ERK、Smad3總蛋白及磷酸化蛋白的

10、表達。
　　結果：1、所有高糖組在1d后都表現(xiàn)出較強的細胞活性，與正常組比較具有顯著差異；與高糖對照組進行比較，方波和脈沖群組在干預2d時開始抑制 HBZY-1細胞株的增殖，正弦組始終沒有顯著差異；脈沖群組細胞活性顯著低于方波組。2、所有高糖組的TGFβ1、FN蛋白表達顯著高于正常組，MMP-2則相反；方波和脈沖群組TGFβ1、FN蛋白表達顯著低于高糖對照組，而在MMP-2蛋白的表達上顯著高于高糖對照組，正弦組在這些蛋白表達上與高

11、糖對照組無顯著差異；脈沖群組在TGFβ1蛋白表達上顯著低于方波組，而在MMP-2蛋白表達上則相反，在FN蛋白表達上則無顯著差異。3、所有高糖組的TGFβ1、FN mRNA表達顯著高于正常組，MMP-2則相反；方波和脈沖群組TGFβ1、FN mRNA表達顯著低于高糖對照組，而在MMP-2 mRNA的表達上顯著高于高糖對照組，正弦組在這些mRNA表達上與高糖對照組無顯著差異；脈沖群組在TGFβ1、FN mRNA表達上顯著低于方波組，在MMP

12、-2 mRNA表達上則相反。4、所有高糖組的磷酸化Smad3蛋白相對表達量顯著高于正常組；脈沖群組磷酸化Smad3蛋白相對表達量顯著低于高糖對照組，而方波和正弦組無顯著差異。5、所有高糖組的磷酸化p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相對表達量顯著高于正常組；方波和脈沖群組磷酸化p38MAPK蛋白相對表達量顯著低于高糖對照組，而正弦組無顯著差異；與方波組相比，脈沖群組磷酸化 p38MAPK蛋白相對表達量顯著低于方波組；脈沖群組磷酸化 ERK蛋

13、白相對表達量顯著低于高糖對照組，而方波和正弦組無顯著差異。
　　結論：方波和脈沖群能有效地抑制高糖誘導的HBZY-1細胞的增殖，一方面通過抑制系膜細胞TGFβ1、FN的合成減少ECM的沉積，另一方面通過促進MMP-2的合成加速ECM降解。此外，方波和脈沖群還通過抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信號通路減少系膜細胞的損傷。脈沖群對系膜細胞的作用效果顯著好于方波。
　　第三部分研究PEMFs對STZ誘導的糖尿病大鼠DN的影響

14、。
　　目的：用體外研究得到的最優(yōu)參數(shù)（PEMFs）對I型糖尿病大鼠進行干預，研究在體環(huán)境下PEMFs對DN大鼠腎臟的保護效果，并驗證其對ECM代謝產(chǎn)物以及參與調節(jié)ECM的通路的影響能否跟體外實驗結果相印證。
　　方法：將成年SD雄鼠隨機按體重的匹配分為3組：正常組（非糖尿病大鼠）、模型組（糖尿病模型大鼠）以及脈沖群組（糖尿病模型+PEMFs照射，8 h/d）。干預6 wks后處死取樣，通過光鏡和電鏡來檢測腎臟的形態(tài)學結構，

15、qRT-PCR檢測腎皮質TGFβ1、FN、MMP-2 mRNA表達，Western blot法測腎皮質TGFβ1、FN、MMP-2、Smad3、p38MAPK、ERK、p-Smad3及p-MAPK蛋白表達。
　　結果：
　　1、經(jīng)過6 wks的PEMFs照射，注射STZ患有DN大鼠的低體重和高血糖癥狀并無緩解。
　　2、PEMFs對于糖尿病大鼠DN病程的發(fā)展，能夠緩解模型大鼠腎臟結構的病理改變，其表現(xiàn)為與模型組相比光鏡

16、下較輕的腎小球、腎小管--間質損傷，以及電鏡下較輕的腎小球基底膜與足細胞損傷。
　　3、與對照組比較，模型組和脈沖群組腎皮質TGFβ1、FN mRNA的表達顯著高于對照組，而MMP-2 mRNA的表達則相反；與模型組比較，脈沖群組能顯著抑制腎皮質TGFβ1、FN mRNA的表達，但是顯著促進MMP-2 mRNA表達。
　　4、與對照組比較，模型組和脈沖群組腎皮質TGFβ1、FN蛋白的表達高于對照組，而MMP-2蛋白表達則相反

17、；與模型組比較，脈沖群組能顯著抑制腎皮質TGFβ1、FN蛋白的表達，但是顯著促進 MMP-2蛋白表達。
　　5、模型組和脈沖群組的磷酸化 Smad3、p38MAPK、磷酸化 ERK蛋白相對表達量顯著高于對照組；脈沖群組磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相對表達量顯著低于模型組。
　　結論：通過體內實驗研究，組織病理學結果證明PEMFs的干預能緩解DN大鼠腎損傷的病理改變過程，其分子機制可能是通過抑制TGFβ1

18、/Smad3、MAPK信號通路的作用，從而影響相關蛋白（TGFβ1、FN、MMP-2）的表達，進而起到緩解DN腎損傷的病理改變的作用，與體外實驗的結果一致，這也證明了TGFβ1/Smad3、MAPK信號通路是參與DN發(fā)生發(fā)展各種途徑中的重要通路。
　　總結
　　通過對電磁場非熱生物效應的研究積累，我們創(chuàng)新性地提出LEMFs可能通過調節(jié)ECM代謝緩解DN病程的理論，也是首次系統(tǒng)地通過體內外實驗研究了LEMFs對大鼠DN的影響，

19、初步證明了 LEMFs中的方波和脈沖群能夠緩解高糖誘導的HBZY-1細胞ECM代謝紊亂，抑制TGFβ1介導的Smad3、MAPK信號通路減輕系膜細胞損傷，再通過體內實驗進一步驗證了脈沖群通過調解 ECM代謝并且抑制TGFβ1介導的Smad3、MAPK信號通路緩解 DN腎損傷程度。我們的實驗研究將LEMFs的修復損傷、消炎消腫的功效與糖尿病引起的腎損傷結合，發(fā)現(xiàn)了LEMFs能夠緩解DN腎損傷程度，并在微觀和宏觀的層面共同揭示了其可能的分子