基于納米Fe3O4@SiO2和功能化石墨烯檢測致病菌的4種免疫傳感器研究.pdf

1、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)和阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii，C.sakazakii）是常見且危害嚴重、致死率較高的食源性致病菌。快速、靈敏和特異地檢測L.monocytogenes和C.sakazakii，對預防和控制其危害，保障人類健康具有較重要意義。電化學免疫傳感器(Electrochemical Immunosensor)由于其

2、良好的選擇性，較高的靈敏度，成本較低和檢測快捷等優(yōu)點在食品安全控制，環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)學等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。目前電化學免疫傳感器在實際應用過程中仍然存在著一些問題:對待測樣品的純度要求高，一般要進行分離純化的前處理，尤其是待檢樣品為細菌時，就需要對待測細菌進行前期的分、純培養(yǎng)，操作復雜，需要較長的時間，同時對檢測環(huán)境和檢測條件要求較高;該技術(shù)的穩(wěn)定性和準確性也有待提高。因此，對電化學免疫傳感器性能的進一步研究改善很有必要。以L.monocyt

3、ogenes和C.sakazakii作為檢測目標菌，結(jié)合多種納米材料復合探針構(gòu)建性能優(yōu)良的新型電化學免疫傳感器，也為其它致病菌的檢測提供了研究模型，以促進電化學免疫傳感器在致病菌快速檢測領(lǐng)域的發(fā)展與應用。
　　本研究主要分以下四個部分進行:
　　1.基于Fe3O4@SiO2富集以還原氧化石墨烯/納米金為非酶標記探針的L.monocytogenes免疫傳感器
　　為了改善電化學免疫傳感器對細菌檢測需要進行分、純培養(yǎng)過程耗

4、時長的不足，以及酶指示物標記過程復雜和易非特異性結(jié)合出現(xiàn)假陽性的不足，研制了新型捕獲探針和非酶標記指示探針。用檸檬酸鈉共還原氯金酸和氧化石墨烯（GO），從而得到還原氧化石墨烯（rGO）/納米金(AuNPs)的復合物（rGO/AuNPs）。并將單核細胞增生李斯特氏菌抗體(Ab)標記在rGO/AuNPs，得到能特異性識別 L.monocytogenes氧化還原指示探針rGO/AuNPs/Ab。以共沉淀法制得Fe3O4，包裹二氧化硅后形成核殼

5、式磁性納米材料Fe3O4@SiO2，經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛(GLU)對Fe3O4@SiO2表面進行氨基化-醛基化修飾，得到活性納米微球，其活性位點與Ab結(jié)合，從而得到免疫磁性納米微球Fe3O4@SiO2/Ab。以Fe3O4@SiO2/Ab為捕獲探針富集待檢樣品中的L.monocytogenes。用免疫夾心法進行檢測，以rGO/AuNPs/Ab為非酶標記指示探針與富集了L.monocytogenes的Fe3O4@S

6、iO2/Ab形成夾心結(jié)構(gòu)，在外加磁力的作用下將夾心結(jié)構(gòu)復合物吸附在絲網(wǎng)印刷碳電極(Screenprinted Carbon Electrode，SPCE)表面，其中AuNPs在鹽酸反應底液中經(jīng)差分脈沖伏安法（Differential Pulse Voltammetry，DPV）預氧化和還原得到還原峰峰電流值。在優(yōu)化后，最佳條件下: DPV響應信號值在L.monocytogenes濃度為2.9×103 CFU·mL-1-2.9×109 C

7、FU·mL-1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為1.8×104 CFU·mL-1(S/N=3)。重復性好，其RSD=5.8％;將該免疫傳感器在4℃條件下儲存30d后穩(wěn)定性為92.9％;特異性好;準確性與國標的符合率為93.3％。由此可見，該新型免疫傳感器有效縮短和省略了分純培養(yǎng)過程，提高了檢測的準確性和一致性，并為為其他致病菌的檢測提供了基礎(chǔ)研究模型。
　　2.構(gòu)建以AuNPs-Thi@rGO為非酶標記物的電化學免疫傳感器用于

8、快速檢測L.monocytogenes
　　經(jīng)對上述研究制備的電化學免疫傳感器分析發(fā)現(xiàn)，雖然其對L.monocytogenes的檢測有較好的準確性和穩(wěn)定性，但在靈敏度方面還不太理想，有待提高。為達到這一目的，用具有顯著氧化還原活性的硫堇(Thi)與rGO以π-π堆積作用形成Thi@rGO復合物。Thi@rGO復合物中帶正電荷的Thi與帶負電荷的AuNPs結(jié)合形成AuNPs-Thi@rGO復合物。經(jīng)此分步合成的AuNPs-Thi@r

9、GO復合物AuNPs結(jié)合的量多，更好的發(fā)揮其生物相容性好。標記單核細胞增生李斯特氏菌抗體(Antibody-L.monocytogenes，Ab)后制成具有免疫活性的Ab/AuNPs-Thi@rGO?；谇笆鲅芯繕?gòu)建的模型的基礎(chǔ)上，以Ab/AuNPs-Thi@rGO作為非酶標記指示探針，形成Fe3O4@SiO2/Ab/L.monocytogenes/Ab/AuNP s-Thi@rGO的夾心結(jié)構(gòu)，在pH6.5的0.1M PBS反應底液中，

10、用DPV方法進行檢測，依據(jù)在電位為-0.23V處的Thi的還原峰峰電流值可實現(xiàn)檢測目的。經(jīng)優(yōu)化后，在最佳條件下的檢測結(jié)果顯示:DPV的還原峰電流值在L.monocytogenes濃度在2.9×102-2.9×108 CFU·mL-1著范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測限為4.7×10 CFU·mL-1(S/N=3);重復性好，其RSD=3.4％;將該免疫傳感器在4℃條件下儲存70 d后穩(wěn)定性為95％;特異性好;準確性與國標的符合率為97

11、％。綜上可知，由 Fe3O4@SiO2/Ab/L.monocytogenes/Ab/AuNP s-Thi@rGO的夾心結(jié)構(gòu)組成的新型免疫傳感器的靈敏度有顯著提高，其線性范圍較寬，準確性和穩(wěn)定性好，為非酶標記細菌免疫傳感器的多樣性提供了良好的基礎(chǔ)研究模型。
　　3.構(gòu)建以AuNPs-NR@rGO為非酶標記物的雙探針阪崎克羅諾桿菌免疫傳感器在上述研究基礎(chǔ)上，為驗證傳感器的擴展應用和后續(xù)實現(xiàn)多重檢測，經(jīng)已報導的文獻和對比實驗結(jié)果，依據(jù)還

12、原峰電位差異顯著性及與rGO結(jié)合方式篩選出性能優(yōu)良的中性紅(Neutral red，NR)為非酶標記指示探針中的氧化還原活性物質(zhì)，構(gòu)建新型C.sakazakii免疫傳感器。經(jīng)標記阪崎克羅諾桿菌抗體（Antibody-C.sakazakii，Anti-C.sakazakii）后，首次獲得Anti-C.sakazakii/AuNPs-NR@rGO指示探針，基于前期研究模型，構(gòu)建Csakazakii的Fe3O4@SiO2/Anti-C.sak

13、azakii捕獲探針，制成Fe3O4@SiO2/Anti-Csakazakii/C.sakazakii/Anti-C.sakazakii/AuNPs-NR@rGO的夾心結(jié)構(gòu)免疫傳感器，在外加磁力的作用下將夾心結(jié)構(gòu)復合物吸附在于4通道絲網(wǎng)印刷碳電極(4 Channels ScreenprintedCarbon Electrode，4-SPCE)表面，在pH7.4的0.1M PBS反應底液中，經(jīng)DPV檢測，獲得電位為-0.62V處NR的還原

14、峰峰電流值。經(jīng)優(yōu)化后，在最佳條件下的檢測結(jié)果顯示:DPV的還原峰電流值在C.sakazakii濃度為3.9×102-3.9×107CFU·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測限為2.2×10 CFU·mL-1(S/N=3);重復性好，其RSD=6.7％;將該免疫傳感器在4℃條件下儲存50 d后穩(wěn)定性為94％;特異性好;準確性與國標的符合率為97.4％。由此可見，該新型免疫傳感器該方法具有良好的穩(wěn)定性，重復性和較高的高靈敏度。

15、>　　4.構(gòu)建基于納米雙重探針同時檢測C.sakazakii和L，monocytogenes免疫傳感器研究
　　在前述研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建優(yōu)良的能同時檢測C.sakazakii和L.monocytogenes的免疫傳感器。在優(yōu)化后，最佳檢測條件下，Thi和NR的還原峰電位值分別是-0.23V和-0.62V，分離明顯，適用于構(gòu)建同時檢測2種目標菌的免疫傳感器。研制Fe3O4@SiO2/Anti-C.sakazakii/C.sakazak

16、ii/Anti-C.sakazakii/AuNPs-NR@rGO和Fe3O4@SiO2/Anti-L.monocytogenes/L.monocytogenes/Anti-L.monocytogenes/AuNPs-Thi@rGO的雙重夾心結(jié)構(gòu)4-SPCE免疫傳感器。結(jié)果顯示:在最佳條件下，DPV的還原峰電流值在C.sakazakii濃度在3.9×103-3.9×108 CFU·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測限為1.1×10

17、2 CFU·mL-1(S/N=3); DPV的還原峰電流值在L.monocytogenes濃度在2.9×102-2.9×106 CFU·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測限為1.5×102 CFU·mL-1(S/N=3);重復性好，其RSD分別為6.2％和8.3％;將該免疫傳感器在4℃條件下儲存30d后穩(wěn)定性為較好;特異性好，無明顯交叉性;準確性與國標的符合率為96.9％。由此可見，該新型免疫傳感器實現(xiàn)了C.sakazakii和