不同清洗劑及其不同作用時間對內(nèi)鏡生物膜清除的實驗研究.pdf

1、內(nèi)鏡生物膜是引起醫(yī)院交叉感染的重要原因之一。細(xì)菌生物膜(bacterial bio-film,BF)是由細(xì)菌及其細(xì)菌自身分泌的胞外多聚物基質(zhì)(extracellular polymericsubstance,EPS)所組成,并不可逆的粘附于非生物或生物的表面,它保護(hù)細(xì)菌免于受環(huán)境的影響并增加細(xì)菌對殺菌劑的抵抗性。生物膜內(nèi)細(xì)菌的抵抗力較浮游細(xì)菌強(qiáng)1000倍。研究發(fā)現(xiàn)生物膜的形成能顯著降低消毒劑的效果。內(nèi)鏡作為一種侵入性、微創(chuàng)性的診治工具已

2、廣泛應(yīng)用于臨床,但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、材質(zhì)多數(shù)不耐高溫、易腐蝕,給使用后內(nèi)鏡的清洗、消毒、滅菌帶來困難,因而更易形成生物膜。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜在消毒后的內(nèi)窺鏡管腔中普遍存在,這在由內(nèi)鏡引起的相關(guān)感染中起著重要的作用。細(xì)菌生物膜的存在,造成內(nèi)鏡應(yīng)達(dá)到的徹底消毒失敗,導(dǎo)致病人之間發(fā)生交叉感染,增加了病人的死亡率及醫(yī)療費(fèi)用,成為醫(yī)院感染潛在的重要影響因素,因此了解內(nèi)鏡生物膜形成的影響因素,尋找控制和清除內(nèi)鏡生物膜的有效方法是值得探討的問題。本研究

3、旨在通過采用制作內(nèi)鏡管腔材質(zhì)的聚四氟乙烯管,也稱特氟龍(Teflon)管,建立一種密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng),使用大腸埃希菌菌懸液,建立內(nèi)鏡生物膜模型,探討不同培養(yǎng)時間對內(nèi)鏡生物膜形成的影響,并使用內(nèi)鏡再處理中推薦的清洗劑作用于生物膜,評價不同清洗劑及其不同作用時間對生物膜的清除效果,以指導(dǎo)臨床內(nèi)鏡再處理中清洗劑的正確選擇及使用,為臨床內(nèi)鏡再處理中生物膜的清除提供科學(xué)的理論依據(jù),從而更好地控制交叉感染,保證醫(yī)療安全,具有重要的臨床現(xiàn)實指導(dǎo)意

4、義。而國內(nèi)尚未見這方面的相關(guān)報道。
　　 目的：建立一種密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)以制備內(nèi)鏡生物膜模型,探討不同培養(yǎng)時間對內(nèi)鏡生物膜形成的影響；使用內(nèi)鏡再處理中推薦的清洗劑作用于生物膜,評價含酶及非含酶清洗劑及其不同作用時間對內(nèi)鏡生物膜的清除效果,以指導(dǎo)臨床內(nèi)鏡再處理中清洗劑的正確選擇及使用,為臨床內(nèi)鏡再處理中生物膜的清除及《內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)操作規(guī)范(2004年版)》的修訂提供科學(xué)的理論依據(jù),對內(nèi)鏡的再處理具有一定的指導(dǎo)意義。

5、>　　 方法：
　　 1.密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)的建立在Vickery所建立的內(nèi)鏡生物膜模型的基礎(chǔ)上,將長100 cm,直徑為4 mm的Teflon管、一條返回管、貯液瓶滅菌后,通過貯液瓶橡膠蓋上的兩個通道(自行設(shè)計的橡膠蓋上的入口和出口),與蠕動泵連成一個循環(huán)通路,從而形成一個密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)。
　　 2.內(nèi)鏡生物膜模型的建立將上述建立的密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)置入Excella E24 Incubator sh

6、akerseries中,取對數(shù)生長期的大腸埃希菌加入適量的生理鹽水,用比濁儀測試菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5×108cfu/mL),加入盛有滅菌營養(yǎng)肉湯的無菌貯液瓶中,將混勻后的無菌貯液瓶中的大腸埃希菌菌懸液和培養(yǎng)基持續(xù)灌流于密閉式連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng),溫度:37℃,由Excella E24 Incubator shaker series維持,速度:80-90 mL/h,由蠕動泵維持,每24 h更換培養(yǎng)基和大腸埃希菌菌懸液,持續(xù)灌流10

7、 d,以期在Teflon管腔內(nèi)表面形成生物膜。每次建模,Teflon管在Excella E24Incubator shaker series中以同樣的方式盤放,以排除由于其位置的不同導(dǎo)致菌液流動的非均衡性對生物膜形成的影響。每次建模,不同培養(yǎng)時間灌流結(jié)束后,取出Teflon管,排空管腔內(nèi)的灌流液,用浸有75％酒精的無菌濕紗布擦拭Teflon管的外表面,再用浸有滅菌PBS的無菌濕紗布擦拭,棄去遠(yuǎn)端10 cm,用無菌手術(shù)刀片2 cm為標(biāo)記分

8、段切開,參照文獻(xiàn),放入盛有25 mL滅菌PBS的無菌容器中進(jìn)行沖洗,輕輕翻轉(zhuǎn)容器5次,棄去PBS,用無菌吸管吸去殘余的溶液,重復(fù)沖洗3次后取出,用無菌紗布吸干多余的液體,洗掉浮游菌。
　　 3.生物膜活菌計數(shù)為了收集第5、7、10 d不同培養(yǎng)時間Teflon管腔內(nèi)表面的生物膜細(xì)菌,不同培養(yǎng)時間灌流結(jié)束后,每組取5段洗掉浮游菌的生物膜測試管,用無菌手術(shù)刀片縱向切開,每段管腔的內(nèi)表面用一個2mm寬的消毒小木棒進(jìn)行擦刮,然后將其與擦刮

9、棒一起放入盛有5 mL滅菌的PBS的試管中,浸沒在超聲水浴中震蕩10 min(42-47 KH、20℃)后,再漩渦震蕩2 min。每個試管溶液在PBS中做系列10倍稀釋,選擇適宜稀釋度,分別取1 mL稀釋液加入無菌平皿中,并傾注冷卻至45℃的M-H瓊脂20 mL,37℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長情況,作細(xì)菌計數(shù)。菌落計數(shù)換算為標(biāo)準(zhǔn)菌落計數(shù)單位。
　　 4.生物膜表面微結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察建模后每組取1段洗掉浮游菌的生物膜測試管置于2

10、.5％戊二醛溶液中4℃固定2 h,以pH為7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次10 min,再以丙酮梯度脫水,每次10 min,醋酸異戊酯置換,CO2臨界點(diǎn)干燥,離子噴金鍍膜,通過SEM進(jìn)行觀察。
　　 5.不同清洗劑對內(nèi)鏡生物膜的干預(yù)采用上述方法進(jìn)行建模,持續(xù)灌流10 d取樣,對每2 cm做一標(biāo)記的Teflon管的每段進(jìn)行編號,排空管腔內(nèi)的灌流液,用浸有75％酒精的無菌濕紗布擦拭Teflon管的外表面,再用浸有滅菌PBS的無菌濕

11、紗布擦拭,棄去遠(yuǎn)端10 cm,用無菌手術(shù)刀片2 cm為標(biāo)記分段切開,共60段標(biāo)本,參照文獻(xiàn),洗掉浮游菌,采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組,隨機(jī)分為空白對照組、含酶清洗劑(Rapidmulti-enzyme cleaner1:400、Scopezime1:270)組及非含酶清洗劑(Intercept1:385)組,上述濃度均為廠家推薦的使用濃度,每種清洗劑組各分為3、5、7 min實驗組,共10組,其中每個實驗組隨機(jī)取6段覆蓋有生物膜的測

12、試管分別單獨(dú)浸沒于10 mL三種不同的清洗劑中,在室溫下作用3、5、7 min后,取出測試管,用無菌PBS溶液洗去殘余的清洗劑,然后使用無菌紗布擦干,其中每組5段用于建模后及不同清洗劑不同時間處理后生物膜內(nèi)活菌計數(shù)測試,1段用于生物膜表面微結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察,方法同上?？瞻讓φ战M即建模成功后洗掉浮游菌的生物膜測試管；實驗組即不同清洗劑不同作用時間處理的生物膜測試管。上述實驗重復(fù)3次。每次實驗的標(biāo)本都是在同一次建模的同一條Teflon管上

13、截取的。
　　 結(jié)果：3次建模測定的第5、7、10 d的生物膜細(xì)菌平均標(biāo)準(zhǔn)菌落計數(shù)(lgCFU/cm2)分別為4.98±0.47、4.82±0.46、4.43±0.52,三組間比較總體有顯著性差異(P<0.05),第5 d、第7 d兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),兩者分別與第10 d比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。通過掃描電鏡觀察,持續(xù)灌流5 d的Teflon管腔內(nèi)表面,細(xì)菌緊密黏附,生物膜細(xì)菌間粘絲樣胞外基質(zhì)形成并交

14、聯(lián)呈網(wǎng)狀；灌流7 d,細(xì)菌胞外多聚物基質(zhì)黏附單個細(xì)胞形成微生物菌落；灌流10 d則形成穩(wěn)定成熟的生物膜。
　　 空白對照組及同種清洗劑作用不同時間后,測定的殘留的生物膜細(xì)菌平均標(biāo)準(zhǔn)菌落計數(shù)(lgCFU/cm2)分別為5.44±0.19,Rapidmulti-enzyme cleaner:4.61±0.52,Scopezime:4.67±0.49,Intercept:1.29±0.13。不同清洗分別作用相同的時間3、5、7min后

15、測定的殘留的生物膜細(xì)菌平均標(biāo)準(zhǔn)菌落計數(shù)(lgCFU/cm2)分別為3.53±1.65,3.52±1.65,3.52±1.65。方差分析顯示,不同處理因素(清洗劑)之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)；而不同時間(3、5、7 min)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。固定時間因素,各組多重比較顯示,兩種含酶清洗劑Rapidmulti-enzyme cleane組和Scopezime組作用后殘留的生物膜細(xì)菌分別與非含酶清洗劑Intercept

16、組兩兩比較均有顯著性差異(P<0.001)；而兩種含酶清洗劑組作用后殘留的生物膜細(xì)菌兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)。各干預(yù)因素和時間之間無交互作用(P>0.05)。由于不同時間之間無顯著性差異,因此分別選擇不同清洗劑作用時間較短的3 min實驗組與空白對照組進(jìn)行比較,四組間比較總體有顯著性差異(P<0.001),三種清洗劑Rapidmulti-enzyme cleaner、Scopezime、Intercept組作用后殘留的生物膜

17、細(xì)菌分別與空白對照組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。掃描電鏡觀察,不同清洗劑分別作用于生物膜3、5、7 min后,含酶清洗劑處理組所殘留的生物膜明顯多于非含酶清洗劑處理組,而同種清洗劑不同時間處理后無明顯差異。
　　 結(jié)論：Teflon管腔內(nèi)表面生物膜的形成與培養(yǎng)時間有密切關(guān)系,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物膜內(nèi)的細(xì)菌量逐漸減少,形成了成熟穩(wěn)定的生物膜。兩種含酶清洗劑作用后殘留在Teflon管腔內(nèi)表面的生物膜細(xì)菌及生物膜明顯