多基因標記輔助選擇及Lbx基因家族的分子生物學(xué)研究.pdf

1、隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,有關(guān)動物遺傳標記輔助選擇方面的研究也在不斷深入。在過去的研究中,已發(fā)現(xiàn)黑素皮質(zhì)素受體-4(Melanocortin-4Receptor,MC4R),心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart FABP,H-FABP),瘦素(Leptin,LEP),氟烷基因(Halothane,HAL),鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)和肌細胞生成素(myogenin,MyoG)等基因與胴體、肉質(zhì)性狀相關(guān)。

2、我們通過PCR-RFLP分析了以上基因在DIV2系(中國瘦肉豬新品系)和7個純種豬中的多態(tài)性分布,并在DIV2系中進行了遺傳效益分析,同時研究了多基因標記同時選擇的可能性。在脊椎動物中,Lbx基因(Ladybird-like genes)家族對于肌肉形成和神經(jīng)發(fā)育起著重要作用。本研究對豬Lbx1和Lbx2基因進行了分離和遺傳效應(yīng)分析。作為重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一,DNA甲基化對基因的表達發(fā)揮重要的調(diào)控功能。因此,我們在肌肉組織中研究了L

3、bx1和Lbx2基因表達和甲基化之間的關(guān)系。并通過誘導(dǎo)分化C2C12細胞,研究DNA甲基化對MyoD(myogenic differentiation1),Myf5(myogenic factor5),Pax7(paired box7)和Lbx1基因表達的影響。主要試驗結(jié)果如下:
　　 1.通過PCR-RFLP分析了MC4R,H-FABP,LEP,HAL,CAST和MyoG基因多態(tài)位點在DIV2系和7個純種豬中的分布,并在DIV

4、2系中進行了遺傳效應(yīng)分析,結(jié)果表明:(1)MC4R基因中的TaqⅠ酶切位點與平均背膘厚、瘦肉率顯著相關(guān)(P<0.05)；(2)LEP基因中的HinfⅠ酶切位點,BB基因個體的日增重極顯著高于AA基因型個體(P<0.01),AB基因個體的日增重顯著高于AA基因型個體(P<0.05)；(3)H-FABP基因第二內(nèi)含子的HaeⅢ酶切位點,DD基因型個體的瘦肉率顯著高于dd基因型個體(P<0.05)；(4)在CAST基因.MspⅠ位點中,EE基

5、因型個體的日增重顯著高于FF基因型個體(P<0.05),EF基因型個體的日增重極顯著高于FF基因型個體(P<0.01)。
　　 2.連鎖不平衡分析顯示:在DIV2系、大白豬、長白豬和八眉豬中,MC4R和LEP基因位點問、LEP和H-FABP基因位點間的連鎖不平衡度不顯著(P>0.05)；在DIV2系、大白豬、長白豬、皮特蘭豬和八眉豬中,MC4R與H-FABP基因位點間的連鎖不平衡度不顯著(P>0.05)。這表明兩個位點間是獨立的

6、,因此對其中一個位點的選擇不會影響另一個位點的等位基因頻率。
　　 3.采用電子克隆方法獲得了兩個候選基因的編碼區(qū)序列:(1)Lbx1,mRNA中的CDS全長846bp,編碼281個氨基酸:(2)Lbx2,mRNA.中的CDS全長591bp,編碼196個氨基酸。通過比較不同物種氨基酸序列,對以上兩個基因進行了系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)豬Lbx1與牛、小鼠、人、犬、類人猿進化關(guān)系較近,豬Lbx2與牛、猩猩、犬進化關(guān)系較近。
　　

7、 4.RT-PCR分析顯示:豬Lbx1基因在肌肉組織中高表達；Lbx2基因在肝、腎和脾中微弱表達,但在肌肉組織中不表達。在出生后肌肉發(fā)育過程中,Lbx1基因的表達處于動態(tài)變化中,一月齡之內(nèi),表達量相對較高,在二月齡時,表達量顯著下調(diào),該變化趨勢與產(chǎn)后肌肉組織中肌衛(wèi)星細胞分化比例的變化一致,由于Lbx1基因已被證實在肌衛(wèi)星細胞分化初期表達,因此我們推測該基因可能與出生后肌肉增生機制有關(guān)。在不同肌肉組織中的分析表明:豬Lbx1基因在股二頭肌

8、中的表達量顯著高于在咬肌,背最長肌和半腱肌中的表達量,推測Lbx1基因的表達量與肌纖維類型并無直接關(guān)系。
　　 5.通過亞硫酸鹽測序技術(shù),在豬背最長肌中分析Lbx1和Lbx2基因啟動子和外顯子1的甲基化狀態(tài)。發(fā)現(xiàn):(1)Lbx1基因的甲基化差異區(qū)在外顯子1處的CpG島內(nèi)；(2)Lbx2基因的甲基化差異區(qū)在CpG島外的啟動子區(qū)。Lbx1基因CpG島內(nèi)的高密度甲基化可能參與下調(diào)該基因在背最長肌中的表達量。
　　 6.通過對豬

9、Lbx1基因組SNP掃描,發(fā)現(xiàn)2個引起酶切位點改變的SNP:g.752A>G和g-1559C>G。在大白×梅山F2代資源家系中進行性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),Lbx1基因g.752A>G突變與眼肌面積和內(nèi)脂率顯著相關(guān)(P<0.05),該突變位于內(nèi)含子,并不影響蛋白結(jié)構(gòu),因此該相關(guān)可能是由于g.752A>G突變與真正的功能突變處于連鎖不平衡狀態(tài)造成的。
　　 7.RT-PCR分析顯示:MyoD和Myf5基因在未分化及分化的C2C12細胞中均