副干酪乳桿菌生物膜反應(yīng)器構(gòu)建及其L-乳酸生產(chǎn)應(yīng)用研究.pdf

1、L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，在食品中主要用作防腐劑或酸味劑等。隨著科技和生活水平的不斷提高，乳酸及其衍生物的用途不斷擴(kuò)展。其中，最引人注目的應(yīng)用在于合成可生物降解材料—聚乳酸。近年來聚乳酸的出現(xiàn)引領(lǐng)了乳酸消費(fèi)的新興領(lǐng)域，致使市場(chǎng)對(duì)高光學(xué)純度的L-乳酸需求旺盛。與傳統(tǒng)的乳酸生產(chǎn)方法相比，生物膜法因其可簡(jiǎn)化固定化過程、提高細(xì)菌密度、且膜內(nèi)細(xì)菌有著更強(qiáng)的耐受力等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種最具潛力的乳酸工業(yè)化生產(chǎn)工具。
　　纖維膜具有高比表面積和

2、高孔隙率的結(jié)構(gòu)，利于細(xì)菌附著，能為細(xì)菌提供理想的生存和繁殖的立體空間，是一種理想的生物膜載體。副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei，LPA)廣泛存在于人體腸道及傳統(tǒng)的乳酪制品中，是發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的良好菌種。本課題以副干酪乳桿菌在醋酸纖維素納米纖維膜(Cellulose acetate nanofibermembrane，NCA)表面形成的乳酸菌生物膜為對(duì)象，構(gòu)建乳酸菌生物膜反應(yīng)器，對(duì)其培養(yǎng)條件、菌體活性、穩(wěn)定性

3、及抗逆性進(jìn)行探究，最后初步評(píng)定其產(chǎn)酸性能。具體研究工作主要圍繞以下幾個(gè)方面展開:
　　1.副干酪乳桿菌生物膜的調(diào)控
　　通過比較副干酪乳桿菌在不同纖維膜材料上形成的生物膜，優(yōu)選出乳酸菌生物膜形成的最佳載體，醋酸纖維素納米纖維膜;探究了培養(yǎng)時(shí)間、接種量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)醋酸纖維素納米纖維膜表面乳酸菌生物膜形成的影響。結(jié)果顯示，生物膜在培養(yǎng)至第三天時(shí)，其菌體干重最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生物膜干重處于穩(wěn)定狀態(tài);接種量對(duì)生物膜干重?zé)o較大的影

4、響;蔗糖和Mg2+對(duì)醋酸纖維素納米纖維膜表面生物膜的形成有一定的促進(jìn)作用。
　　2、副干酪乳桿菌生物膜結(jié)構(gòu)與生理特性
　　通過多種表征手段對(duì)副干酪乳桿菌生物膜的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，其中，采用活菌計(jì)數(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析方法，對(duì)副干酪乳桿菌生物膜內(nèi)總活菌數(shù)和不同層面的活菌率進(jìn)行研究;采用化學(xué)法對(duì)胞外聚合物中多糖和蛋白質(zhì)隨時(shí)間的變化規(guī)律進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的乳酸菌生物膜具有典型的生物膜形態(tài)和結(jié)構(gòu);隨著培養(yǎng)時(shí)間的

5、增加，生物膜內(nèi)活菌數(shù)雖有下降，但仍維持1012 CFU/g，生物膜底層活菌率普遍低于其內(nèi)層和表層，但綜合生物膜每層平均活菌率始終維持在80％以上;胞外聚合物中多糖和蛋白質(zhì)的含量均隨著生物膜培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，其中蛋白質(zhì)的含量始終高于多糖。
　　3、副干酪乳桿菌生物膜的穩(wěn)定性及抗逆性
　　通過振蕩和超聲法對(duì)醋酸纖維素納米纖維膜表面的乳酸菌生物膜進(jìn)行處理，考察生物膜在材料上的短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。采用熱處理、酸堿處理和抗生素

6、處理，考察生物膜的抗逆性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在醋酸纖維素納米纖維膜上形成的生物膜具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，同時(shí)還具有極強(qiáng)的抗逆特性，在50℃、100℃、200℃、pH1.2、pH2、pH10以及0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL三種不同抗生素濃度條件下，均表現(xiàn)出比懸浮狀態(tài)更強(qiáng)的耐受力，從一定角度證明了本實(shí)驗(yàn)中乳酸菌生物膜具有較強(qiáng)對(duì)于不良環(huán)境的抵抗能力?；诖私Y(jié)果，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法對(duì)副干酪乳桿菌生物膜細(xì)胞及其懸浮細(xì)胞的基

7、因進(jìn)行表達(dá)差異分析。結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌生物膜細(xì)胞基因表達(dá)模式不同于懸浮細(xì)胞，差異基因中的整合酶、多要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞分裂蛋白、β-內(nèi)酰胺水解酶在副干酪乳桿菌生物膜成熟及抗藥性作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　4、副干酪乳桿菌生物膜反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸
　　首先通過搖瓶發(fā)酵，對(duì)副干酪乳桿菌在醋酸纖維素納米纖維膜上形成的生物膜和懸浮菌的產(chǎn)酸能力進(jìn)行對(duì)比;再通過構(gòu)建乳酸菌生物膜反應(yīng)器，考察初始葡萄糖濃度、發(fā)酵液pH及流速對(duì)副干酪乳桿菌

8、生物膜生產(chǎn)L-乳酸性能的影響規(guī)律，并對(duì)其長(zhǎng)期發(fā)酵穩(wěn)定進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，生物膜發(fā)酵過程中沒有延滯期，產(chǎn)酸效率普遍高于懸浮菌;且當(dāng)初始葡萄糖濃度為80 g/L、pH為6.5、流速為0.3 L/h時(shí)，其L-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化效率最高;在30天共9批發(fā)酵過程中，前7批的L-乳酸平均轉(zhuǎn)化率在75％以上，從第8批開始反應(yīng)器生產(chǎn)效率略微有所下降。這說明所構(gòu)建的副干酪乳桿菌生物膜反應(yīng)器不僅具有較好的L-乳酸發(fā)酵性能，而且生產(chǎn)穩(wěn)定。這一結(jié)果為高密度連續(xù)發(fā)酵