一株干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究.pdf

1、乳酸是少數(shù)已工業(yè)化的生物基化學(xué)品之一，利用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，具有產(chǎn)量高和成本低的優(yōu)勢。但是目前存在的主要問題是L-乳酸的光學(xué)純度低，不能滿足聚L-乳酸對高品質(zhì)L-乳酸的要求。本論文針對這個問題對L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，通過紫外和DES誘變獲得高光學(xué)純L-乳酸的突變菌株進行了研究。
　　對實驗室篩選得到的一株野生型生產(chǎn)L-乳酸的菌種采用16SrRNA鑒定并通過BL AS T進行序列相似性比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將此菌株命名為干

2、酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ZW-63A。
　　采用單因素影響實驗和響應(yīng)面分析，優(yōu)化了L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。獲得L-乳酸發(fā)酵的最佳條件為：種子培養(yǎng)方式采取先靜置再振蕩培養(yǎng)的方式(靜置12h+振蕩8 h)接入發(fā)酵培養(yǎng)基時L-乳酸產(chǎn)量最高；中和劑CaCO3采用一次性添加10g/100 mL時L-乳酸產(chǎn)量最高；碳源采用葡萄糖、氮源采用酵母粉時L-乳酸產(chǎn)量最高，最佳接種量為10％，最適裝液量為100 mL。對

3、L-乳酸產(chǎn)量影響較大的三個因素葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉進一步采取Box-Behnken中心組合和響應(yīng)面優(yōu)化，得到三個因素添加量最佳組合為：葡萄糖17.85 g/100 mL，酵母粉1.27g/100 mL，乙酸鈉0.19 g/100 mL，在最優(yōu)發(fā)酵條件下L-乳酸達到了146.67g/L，是優(yōu)化前的2.03倍，優(yōu)化后的L-乳酸光學(xué)純度為96.21%，比優(yōu)化前提高了6.09%。
　　在干酪乳桿菌ZW-63A發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸中，采用吐溫

4、80和甜菜堿作為兩種滲透壓緩沖保護劑。結(jié)果顯示，與吐溫80相比，甜菜堿作為緩沖劑時能夠較明顯的提高L-乳酸的產(chǎn)量，并經(jīng)優(yōu)化當(dāng)甜菜堿添加量為2g/L時L-乳酸產(chǎn)量達到最大。在搖瓶水平上，以嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、布氏乳桿菌作為三株驗證試驗菌株，實驗結(jié)果表明，與吐溫80相比，甜菜堿作為緩沖劑時均能夠提高L-乳酸產(chǎn)量和乳酸脫氫酶酶活。
　　采用甜菜堿和吐溫80作為滲透壓緩沖保護劑，通過5L發(fā)酵罐上罐發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。實驗結(jié)果表明，甜菜

5、堿作為緩沖劑時L-乳酸產(chǎn)量依然比吐溫80的高，甜菜堿作為緩沖劑時L-乳酸產(chǎn)量為190 g/L，L-乳酸的產(chǎn)率為95.47%，L-乳酸的生產(chǎn)速率為2.64g/l/h，L-乳酸的光學(xué)純度為97.03%，吐溫80作為緩沖劑時，L-乳酸的產(chǎn)量為170g/L，L-乳酸的產(chǎn)率為91.15%，L-乳酸的生產(chǎn)速率為2.36g/l/h，L-乳酸的光學(xué)純度為96.78%。
　　以前面發(fā)酵優(yōu)化后的最適L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，對干酪乳桿菌

6、ZW-63A進行了紫外和硫酸二乙酯(DES)誘變。確定了紫外誘變菌液稀釋最佳濃度為10-5，紫外誘變最佳時間為60S，經(jīng)初篩和復(fù)篩后得到一株L-乳酸光學(xué)純度為97.57%的突變菌株，然后對紫外誘變篩選得到的突變菌株進行DES誘變，確定DES最佳體積分數(shù)為1%，DES最佳誘變時間為30min，經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到一株L-乳酸光學(xué)純度為98.83%和L-乳酸產(chǎn)量為140 g/L的突變菌株。經(jīng)過遺傳穩(wěn)定性試驗，該突變菌株穩(wěn)定性良好，并將其命名為