毛細(xì)管電泳應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離和檢測(cè).pdf

1、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)是離子或荷電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中組分之間的淌度或分配系數(shù)的差異，而實(shí)現(xiàn)高效、快速分離的一類電泳新技術(shù)。與傳統(tǒng)的高效液相色譜技術(shù)相比，毛細(xì)管電泳具有分離模式多、分離效率高.、分析速度快、試劑和樣品用量少、成本低、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，己廣泛應(yīng)用在無(wú)機(jī)離子、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、環(huán)境樣品、藥物、食品和手性對(duì)映體的分離分析。毛細(xì)管電泳的理論

2、和應(yīng)用研究是分析化學(xué)最活躍的領(lǐng)域之一。迄今為止，如何提高毛細(xì)管電泳對(duì)藥物的分離選擇性和檢測(cè)靈敏度仍然是分析工作者關(guān)注的問(wèn)題之一。本論文在前人工作的基礎(chǔ)上建立基于高效快速分離，高靈敏度檢測(cè)的毛細(xì)管電泳新體系，并將其應(yīng)用到實(shí)際生物樣品的分析中，圍繞“高分離柱效、高靈敏度”為主要目標(biāo)，主要開展了如下的探索性工作:
　　 第一部分，回顧了毛細(xì)管電泳的發(fā)展歷史，對(duì)毛細(xì)管電泳技術(shù)的基本理論、分離模式、應(yīng)用特點(diǎn)，以及聯(lián)用技術(shù)等進(jìn)行了介紹。著重

3、討論了毛細(xì)管電泳的修飾分離模式用于實(shí)際樣品分析中的發(fā)展熱點(diǎn)。最后，以方法的建立，完善優(yōu)化分離體系為出發(fā)點(diǎn)，提出本論文的主要研究?jī)?nèi)容。
　　 第二部分，研究了運(yùn)用β-CD修飾的自組裝膠束毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)手段快速分離親脂性手性異構(gòu)體1-苯基-順，反-四氫異喹啉(ER，ES)。運(yùn)行緩沖液為含有30mM脫氧膽酸鈉，20mMβ-CD和20％(v/v)乙腈的磷酸鹽(35mmol/LpH=7.85)膠束體系。緩沖液中，表面活性劑脫氧膽酸

4、鈉形成膠束粒子，β-CD作為手性選擇劑和ACN作為有機(jī)溶劑提高分離效率。優(yōu)化了檢測(cè)電壓，分離電壓，進(jìn)樣時(shí)間和緩沖液的組成，異構(gòu)體在12min內(nèi)達(dá)到了手性分離。被分析物遷移時(shí)間和峰面積(n=5)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別是2.3％(ER)，2.7％(ES)and2.0％(ER)，3.5％(ES);手性異構(gòu)體的檢測(cè)限是0.5μmol/L(ER)，0.2μmol/L(ES)。在ER/ES為1/500的條件下，能測(cè)定出恒量ER的濃度。這種方法

5、成功應(yīng)用于跟蹤藥物合成中間體ES中異構(gòu)體ER的量。
　　 第三部分，在膠束修飾毛細(xì)管電泳提高分離效率的基礎(chǔ)上，探索微乳體系毛細(xì)管內(nèi)壁分子膜修飾分離手性藥物。聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)/β-環(huán)糊精(β-CD)修飾微乳毛細(xì)管電泳用來(lái)手性分離舍曲林異構(gòu)體。由乙腈，十二烷基硫酸鈉，正丁醇和環(huán)己烷與硼砂組成的微乳緩沖液極大地提高了舍曲林順?lè)串悩?gòu)體的分離效率。在優(yōu)化條件下，4種順?lè)串悩?gòu)體達(dá)到了基線分離。四種順?lè)串悩?gòu)體的檢測(cè)下限分別是

6、0.15mg/mL(1S，4S)，0.15mg/mL(1R，4R)，0.30mg/mL(1S，4R)和0.30mg/mL(1R，4S)。同時(shí)研究了該體系的分離機(jī)理并用于實(shí)際樣品左洛夫片劑中有效成分的測(cè)定，取得了滿意的測(cè)定效果。
　　 第四部分，本著提高檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，為生命體系中藥物代謝及原產(chǎn)物的測(cè)定奠定基礎(chǔ)，提出運(yùn)用電化學(xué)方法修飾電極測(cè)定市售片劑中的藥物含量的方法。通過(guò)電化學(xué)鍵合蘆丁對(duì)玻碳電極進(jìn)行修飾。該修飾電極對(duì)舍曲林的氧

7、化具有電催化作用，因此用來(lái)測(cè)定藥物片劑中舍曲林的含量。同時(shí)對(duì)電極修飾的機(jī)理和修飾電極的電化學(xué)行為進(jìn)行了系統(tǒng)的討論。結(jié)果顯示，玻碳電極的修飾是通過(guò)蘆丁作為邁克爾反應(yīng)的的受體親核進(jìn)攻碳表面的羥基而鍵合。修飾上去的蘆丁分子內(nèi)酚羥基發(fā)生2e/2H+可逆的氧化還原反應(yīng)催化了舍曲林在電極表面的氧化。使用紅外光譜和電化學(xué)技術(shù)考查了舍曲林的氧化機(jī)理。結(jié)果顯示，舍曲林在修飾電極表面的催化氧化屬于不可逆2e/2H+氧化反應(yīng)。使用脈沖伏安分析法測(cè)定了舍曲林的

8、氧化峰電流與其濃度在3.0-90.0μM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其檢測(cè)限為1.0μM。在此方法基礎(chǔ)上，對(duì)左洛夫樣品中舍曲林濃度的進(jìn)行了測(cè)定，同樣取得了滿意的效果。
　　 第五部分，在聚合物修飾毛細(xì)管電泳條件下，兩種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌BS和金黃葡萄球菌SAR）與一種革蘭氏陰性菌（銅綠假單孢菌PA）實(shí)現(xiàn)了很好的基線分離。聚合物（聚環(huán)氧乙烷，PEO）和β-環(huán)糊精(β-CD)的聯(lián)合使用提高了細(xì)菌BS和PA的分離效率。分離條件中的影響因

9、子例如PEO和β-CD的濃度，緩沖體系的pH值與濃度，分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間等。由于溶菌酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的破壁而催化水解作用，因此，在革蘭氏陰性菌PA共存的條件下，BS和SAR的水解情況進(jìn)行了探討，根據(jù)不同時(shí)間BS和SAR的水解量，計(jì)算出水解速率常數(shù)。結(jié)果顯示，修飾劑PEO和β-CD，還有緩沖液的pH值和濃度都不僅影響了分離效率，同時(shí)，在不適合的pH和濃度范圍內(nèi)，都將導(dǎo)致細(xì)菌的破壁作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳分離條件為10mmol/L

10、PBS(pH7.2)，PE00.02％和β-CD0.02％，進(jìn)樣時(shí)間2s，分離電壓控制在20kV。BS,PA和SAR三種菌的檢測(cè)限分別為1.2×102cells/mL，1.1×102cells/mL和0.8×102cells/mL。雞蛋清溶菌酶(HEWL)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌BS，SAR有很好的催化水解作用，但對(duì)PA的水解作用不明顯。這樣為細(xì)菌革蘭氏菌種的篩選提供了可參考的方法。
　　 第六部分，在上述運(yùn)用毛細(xì)管電泳修飾體系分離生物手