湖泊和土壤中的微生物群落對氮磷輸入的響應研究.pdf

1、微生物在環(huán)境中廣泛分布，它們在元素的生物地球化學循環(huán)、污染物的生物分解、植物的健康生長、生態(tài)系統(tǒng)的維持和可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用。其中鐵還原細菌（iron-reducing bacteria，F(xiàn)eRB）因為其獨特的胞外電子傳遞能力而備受關(guān)注，它們可以利用包括Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、甲基橙、硝基苯等多種物質(zhì)作為電子受體并將其還原，因此在金屬元素循環(huán)和污染物降解等方面有著重大潛能。其重要的模式菌屬為Geobacter和Shewanell

2、a。隨著工農(nóng)業(yè)發(fā)展和城鎮(zhèn)化進程，大量的氮、磷等營養(yǎng)元素被釋放到環(huán)境中，在土壤、水體中富集，導致湖泊等水體環(huán)境的富營養(yǎng)化愈加嚴重和土壤中的營養(yǎng)濃度發(fā)生改變，可能會對其中的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生劇烈影響。解析微生物群落對富營養(yǎng)化和氮肥的響應和機制，對土壤和水體的富營養(yǎng)化治理和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。因此，本論文以微生物群落結(jié)構(gòu)為研究對象，深度探索了湖泊沉積物中Geobacter和Shewanella為代表的鐵還原微生物對富營養(yǎng)化的響應和

3、農(nóng)田土壤中微生物群落對氮肥施加的響應和機制，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.Shewanella新特異性探測引物的設計及應用
　　Shewanella作為模式鐵還原細菌，在環(huán)境修復、生物產(chǎn)電等方面具有極大潛力。隨著越來越多的Shewanella新菌種被發(fā)現(xiàn)，為了更加準確地調(diào)研Shewanella在環(huán)境中的分布，需要覆蓋率更高的特異性引物來對其進行檢測。首先，基于目前已知的Shewanella屬菌株的16S rDNA序列的比

4、對結(jié)果，設計了Shewanella新引物對640F/815R和211F/815cR。然后，通過在線模擬引物匹配軟件和實際環(huán)境樣品的檢測，與傳統(tǒng)的引物對783F/1245R、211F/1259R和120F/220R在特異性和覆蓋率方面進行了比較。計算模擬工具測試的結(jié)果和克隆文庫數(shù)據(jù)分析的結(jié)果均表明新設計的引物對640F/815R和211F/815cR在覆蓋率和特異性方面均較傳統(tǒng)引物表現(xiàn)更好。將新引物對應用于環(huán)境實際樣品檢測，在淡水環(huán)境中檢

5、測到比之前報道的更加豐富和多樣的Shewanella，并發(fā)現(xiàn)海洋環(huán)境中的Shewanella種類與淡水環(huán)境中存在顯著差異。Shewanella在污水處理廠中的豐度和多樣性分布受到不同工藝和處理單元的影響，皮爾森相關(guān)性分析顯示污水處理廠中的Shewanella豐度與混合液懸浮固體濃度顯著負相關(guān)，但是在底泥樣品中Shewanella豐度與營養(yǎng)物質(zhì)顯著正相關(guān)，表明Shewanella在不同環(huán)境中的分布可能受不同因素的影響。所設計的新特異性引物

6、能夠幫助更準確地調(diào)研Shewanella的豐度和多樣性分布特點，評估其在不同環(huán)境中參與生物地球化學循環(huán)的潛在作用。
　　2.鐵還原細菌在富營養(yǎng)化巢湖湖底沉積物中的分布、豐度和多樣性特征的研究
　　雖然鐵還原細菌廣泛分布于各種環(huán)境中，但是關(guān)于它們在富營養(yǎng)化淡水系統(tǒng)中的豐度和多樣性分布特征尚不清楚。因此，分別采用Geobacter和Shewanella特異性引物和細菌通用引物，利用定量PCR、克隆文庫分析和高通量擴增子測序等技術(shù)

7、，探索了鐵還原模式微生物Geobacter和Shewanella，以及總FeRB在富營養(yǎng)化巢湖沉積物中的分布特點。研究結(jié)果表明，鐵還原細菌廣泛分布于富營養(yǎng)化巢湖底泥中，且Geobacter、Shewanella和總FeRB的豐度在高污染區(qū)顯著高于低污染區(qū)。其中，在冬季和春季，Geobacter的豐度要高出Shewanella至少一個數(shù)量級。Geobacter的生物多樣性顯著高于Shewanella，總共檢測到61個與Geobacter相

8、關(guān)的OTUs，但是只有3個與Shewanella相關(guān)的OTUs?？侳eRB主要由Desulfuromonas和Geobacter構(gòu)成。皮爾森相關(guān)性、CCA和RDA的分析結(jié)果表明Geobacter、Shewanella和FeRB的豐度和群落結(jié)構(gòu)與碳、氮和磷含量顯著相關(guān)，而與電子受體-鐵的含量不相關(guān)。因此，在高度富營養(yǎng)化淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，營養(yǎng)水平是調(diào)控鐵還原細菌分布、豐度和多樣性的主要環(huán)境因子。FeRB的豐度和多樣性與富營養(yǎng)化水平的高度關(guān)

9、聯(lián)性表明FeRB在水體富營養(yǎng)化治理和污染物修復方面具有重要潛力。
　　3.無機氮肥及其引起的pH變化對柳枝稷農(nóng)田土壤中細菌和真菌群落影響的解析
　　雖然關(guān)于無機氮肥對微生物群落影響的研究很多，但是細菌和真菌群落分別對氮肥和氮肥引起的pH變化的響應及機制尚不清楚。位于美國威斯康辛州的ARL和密歇根州的KBS位點的柳枝稷試驗田分別有不同長度的施肥時間，ARL的短期施肥和KBS的長期施肥的相互比較可以幫助區(qū)分開氮肥和pH對微生物群

10、落的影響。分別采用基于16S rRNA基因和ITS2基因的高通量擴增子測序技術(shù)，對細菌和真菌群落進行了全面分析。結(jié)果顯示ARL位點的細菌群落結(jié)構(gòu)和組成在三個氮肥濃度（0、56、196kg N/ha）之間無顯著區(qū)別，但是在KBS位點細菌群落結(jié)構(gòu)和組成受到高濃度氮肥的顯著影響，而低濃度氮肥對其無明顯影響。pH被發(fā)現(xiàn)是引起細菌群落變化的關(guān)鍵影響因子。與細菌群落不同，pH對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較弱，真菌的群落結(jié)構(gòu)和組成更易受到氮肥本身的促進或者抑

11、制作用。這些結(jié)果使對微生物群落對氮肥的響應機制有了更深刻的認識，為生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的維持和實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的思路。
　　4.無機氮肥對微生物群落在柳枝稷生長周期的影響及無機氮肥對微生物宏基因組和微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡影響的分析
　　以往的相關(guān)研究多關(guān)注于微生物群落結(jié)構(gòu)和組成與氮肥之間的響應關(guān)系，而關(guān)于氮肥對微生物宏基因組和微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡的影響卻缺少研究，在植物不同發(fā)育階段氮肥作用下的微生物群落響應方面的信息也比較匱乏

12、。通過高通量擴增子和鳥槍法宏基因測序技術(shù)，并結(jié)合網(wǎng)絡構(gòu)建等方法，系統(tǒng)探索了這些問題。研究結(jié)果表明，在同一氮肥濃度下，微生物群落結(jié)構(gòu)在整個柳枝稷的生長周期總體比較穩(wěn)定，柳枝稷的生長并沒有引起微生物群落的顯著變化。但是，高濃度氮肥卻使KBS位點的細菌和真菌群落在柳枝稷不同生長周期的變化幅度增大。網(wǎng)絡分析結(jié)果表明在KBS位點，低濃度氮肥使微生物群落抗干擾能力增強，而高濃度氮肥降低了群落抗干擾能力。還發(fā)現(xiàn)在氮肥的影響下，真菌與真菌之間的相互作用

13、減弱，并且微生物群落間的負相互作用關(guān)系也減弱，從而使總體的相互作用復雜度降低。宏基因組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果顯示KBS位點的高濃度氮肥促進很多代謝過程，尤其是碳水化合物的相關(guān)代謝，但是同時氮肥也會抑制很多功能基因表達，特別是信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因。氮循環(huán)過程中相關(guān)基因的注釋結(jié)果顯示氮肥抑制了固氮作用，促進氨氧化相關(guān)基因表達，而對反硝化過程無顯著影響。總之，氮肥對微生物群落的影響是多方面的，群落結(jié)構(gòu)和生理功能代謝的變化可能會引起微生物之間的相互作用網(wǎng)絡的