微量液體處理技術(shù)的研究及其在自動化核酸分析系統(tǒng)中的應(yīng)用.pdf

1、在全球化進程不斷加強的背景下各種已知或未知疾病的大規(guī)模爆發(fā)事件不斷發(fā)生。一旦發(fā)生大規(guī)模的高致病性傳染病事件，如2002年爆發(fā)的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)，大量疑似感染者需要在最短的時間內(nèi)進行確診，以便對疫情進行準確地評估與制定有效的防控措施。最為有效的辦法是利用更加快速、準確、自動化程度高的高通量核酸檢測技術(shù)，通過檢測病人樣本中病原體的核酸序列完成快速確診，實現(xiàn)更短的檢測窗口期。
　　自動化核酸分析系統(tǒng)作為核酸檢測技術(shù)的實

2、施平臺，其實現(xiàn)涉及到多項技術(shù)難題。其中，微量液體處理技術(shù)作為相關(guān)自動化設(shè)備的核心技術(shù)之一，其準確性與重復性將直接影響到實驗結(jié)果的可靠性。雖然目前已報道了多種可用于微量液體操作的技術(shù)方案，但大都難以實際應(yīng)用。尤其是在液體特性差異較大，移液量程范圍較寬，及交叉污染極易發(fā)生的核酸檢測實驗中，基于空氣置換式的移液方式仍然是實現(xiàn)此類自動化設(shè)備的首選技術(shù)方案。
　　本論文首先研究了基于空氣置換式移液技術(shù)的原理，分析了微量移液過程中的多種影響因

3、素，并提出了基于液體特性的動態(tài)校準模型;同時，對自動化液體處理技術(shù)中的液面檢測技術(shù)和移液過程實時監(jiān)控技術(shù)進行了研究，并設(shè)計了以多通道空氣置換式移液模塊為核心的自動化液體處理平臺;在上述的研究基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了高通量的核酸分析系統(tǒng)，實現(xiàn)了臨床樣本的自動化處理及分析。具體內(nèi)容包括:
　　1.空氣置換式微量移液技術(shù)的研究
　　研究了空氣置換式移液技術(shù)的基本原理，并根據(jù)ISO-8655及JJG646-2006標準建立了移液性能的測試平

4、臺及相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法;對影響移液性能的多種因素（環(huán)境因素、設(shè)備因素、操作因素及液體特性）進行了分析，并根據(jù)這些因素的來源及影響程度提出了相應(yīng)的優(yōu)化措施;為進一步提高移液性能，建立了基于液體特性（液體密度及粘稠度）的動態(tài)校準模型，經(jīng)校準后的20μL移液器對于無水乙醇的移液誤差平均降低了3.3％，對于血液的移液誤差平均降低了0.93％。
　　2.自動化液體處理技術(shù)的研究
　　首先對自動化移液操作中的兩項關(guān)鍵輔助技術(shù)進行了研究，

5、分別為:構(gòu)建了基于電容傳感器的液面檢測裝置，測量了吸液頭在不同狀態(tài)、不同液體類型的情況下的電容值變化，測得空氣中的電容值約為4.6 pF，液體為大于6.1 pF，據(jù)此可判斷出吸液頭在接觸液面時的高度;研究了基于氣壓傳感器的移液過程實時監(jiān)控技術(shù)，建立了基于純水操作的標準氣壓變化模型及其分析方法，據(jù)此設(shè)計了移液過程實時監(jiān)控程序，實現(xiàn)了對多種異常（如空吸、氣泡、堵塞等）操作的判別及記錄。其次，設(shè)計了基于空氣置換式的8通道微量移液模塊，并與機械

6、抓手模塊、機械臂定位系統(tǒng)一道構(gòu)成了自動化的液體處理平臺。其中，8通道微量移液模塊的量程范圍為1～300μL，實驗測得在20μL、100μL及200μL處的移液誤差分別為0.61％，0.75％和0.51％，重復性為0.62％，0.53％及0.56％（CV值）;機械臂定位系統(tǒng)的重復定位精度分別為30.71μm，27.10μm及23.60μm。以上性能均符合設(shè)計要求，可滿足自動化液體處理的需求。
　　3.自動化核酸分析系統(tǒng)的研發(fā)

7、　　按照高通量核酸分析實驗的需求，將目標系統(tǒng)分為樣本處理、核酸擴增及信號檢測共三大部分。目標系統(tǒng)以自動化液體處理平臺為主體，通過集成相應(yīng)的功能模塊實現(xiàn)自動化的核酸檢測流程。其中，多功能核酸提取模塊可在2小時內(nèi)完成對96個樣本的核酸提取操作，且不需要額外的轉(zhuǎn)板操作;高通量磁分離模塊提供了1個自動化的磁分離工位、1個快速加熱工位及2個標準SBS耗材工位，可對多種96孔樣式耗材進行磁分離操作;恒溫震蕩模塊實現(xiàn)了溫度及轉(zhuǎn)速可調(diào)的孵育裝置，其溫度

8、均一性為±1℃，并設(shè)有5擋調(diào)速功能。整體系統(tǒng)以自動化液體處理平臺為基礎(chǔ)，采用統(tǒng)一的電器控制方案，并提供可編程界面對實驗流程進行在線設(shè)計，實現(xiàn)了從樣本輸入到結(jié)果輸出的自動化實驗流程。
　　4.自動化核酸分析系統(tǒng)的性能測試與臨床應(yīng)用
　　對于自動化系統(tǒng)的移液性能測試，首先采用Bradford方法對自動化及手工配制的BSA梯度稀釋液進行測定，兩者標準曲線的線性度分別為0.984和0.974，重復性分別為2.00％和2.35％（CV

9、值）;其次，實驗對多達20塊的96孔板進行了重鉻酸鉀梯度稀釋液的配制，自動化系統(tǒng)、手工8通道移液器及手工單通道移液器的操作重復性分別為1.94％，2.40％及4.54％;結(jié)果說明，自動化系統(tǒng)的移液準確性和重復性均優(yōu)于手工操作。接下來驗證了自動化核酸分析系統(tǒng)的樣本處理能力，具體為:對已知濃度的HBV質(zhì)粒樣本分別進行自動化及手工核酸提取操作，兩者提取效率分別為95.01％和94.7％;對高通量的E.coli核酸提取實驗的結(jié)果表明，自動化系統(tǒng)