發(fā)光功能化納米材料及其在生物成像中的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，隨著細胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對細胞內(nèi)的活性物質(zhì)、細胞信號傳導(dǎo)及細胞凋亡過程等方面的研究越來越深入。基于發(fā)光材料開發(fā)出的可視化分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)分析。目前，用于生物成像分析的探針主要是基于有機染料分子的熒光成像，它們?yōu)榛罴毎治鎏峁┝擞行У某上駲z測手段。但有機熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易淬滅及發(fā)光強度不穩(wěn)定等缺點。如何設(shè)計出新型發(fā)光生物探針以提高生物成像分析的選擇性和準確性，實現(xiàn)長時間的實時動態(tài)監(jiān)測，是急需

2、解決的問題。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，由于量子點熒光探針發(fā)射峰窄，光穩(wěn)定性好，在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用潛力受到廣泛關(guān)注。但是，傳統(tǒng)的量子點多數(shù)由重金屬構(gòu)成，由此帶來的潛在生物毒性限制了其在生物成像領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。而另一種不需要光源激發(fā)的發(fā)光技術(shù)，包含了生物發(fā)光在內(nèi)的化學(xué)發(fā)光，是一個多元的化學(xué)反應(yīng)體系，被廣泛的應(yīng)用于體液及組織提取液中的活性物質(zhì)檢測。但其不能無損的進入細胞，且多元的反應(yīng)組分在生物體內(nèi)的擴散速率差異也制約了化學(xué)發(fā)光技術(shù)在生物體內(nèi)成

3、像上的應(yīng)用。
　　為了解決上述問題，本論文基于兩種新型的納米材料，即MoS2量子點和包裹介孔二氧化硅殼層的聚離子液納米反應(yīng)器，開發(fā)出了具有細胞成像分析功能的新型熒光探針和化學(xué)發(fā)光探針。
　　本論文主要包括以下四個方面的內(nèi)容：
　　1、通過改進的化學(xué)剝離方法，用Na在160℃，真空條件下插入到MoS2粉末的片層中，結(jié)合超聲處理制備了具有強熒光性質(zhì)的單片層MoS2量子點。應(yīng)用透射電子顯微鏡、激光動態(tài)光散射粒徑儀及Zeta電

4、位儀、原子力顯微鏡、紫外可見吸收光譜、熒光分光光度計和X射線衍射儀等對所合成的MoS2量子點進行了表征。所制得的MoS2量子點粒徑約為3.5nm，表面電荷為-20.2 mV，具有良好的水溶性，且熒光穩(wěn)定性好的特點。通過MTT法檢測了MoS2量子點的細胞毒性。發(fā)現(xiàn)MoS2量子點的生物相容性好的優(yōu)點。通過毛細管電泳儀分析MoS2量子點和含巰基氨基酸的相互作用，結(jié)果表明MoS2量子點可以和含巰基的化合物共價結(jié)合。通過熒光顯微鏡考察了MoS2量

5、子點對細胞的標記。結(jié)果表明MoS2量子點能順利穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，且能通過與細胞內(nèi)巰基化合物的作用長時間的保留在細胞中，能對細胞進行長時間的熒光成像。MoS2量子點為長時間活細胞熒光成像示蹤分析和研究細胞的微結(jié)構(gòu)提供了有效的研究方法和手段。
　　2、由于 MoS2量子點具有尺寸小、生物相容性好、易于被巰基修飾的優(yōu)點。我們通過表面修飾的方法在MoS2量子點表面修飾上兩種具有pH響應(yīng)的熒光配體（LA-Flu和LA-RhB）。進而開發(fā)

6、出了pH檢測范圍更廣的pH響應(yīng)比率熒光探針（dl-MoS2）。LA-Flu在酸性條件下熒光強度降低，堿性條件下熒光強度升高。而LA-RhB在酸性條件下熒光強度增加，在堿性條件下熒光強度降低。通過兩個配體熒光強度的比值可以反映出細胞內(nèi)的pH值。與單一波長響應(yīng)的pH熒光探針相比，比率熒光探針有效排除了探針濃度因素帶來的誤差。大多數(shù)具有pH響應(yīng)的單波長熒光探針，對 pH響應(yīng)的范圍限制在探針 pKa±1的范圍內(nèi)。dl-MoS2通過兩個不同pKa

7、值的pH響應(yīng)熒光配體的熒光比率隨pH的變化，使dl-MoS2在整個細胞內(nèi)pH范圍內(nèi)（pH=4-8）具有線性響應(yīng)。同時可以通過MoS2量子點表面的配體比，有針對性的調(diào)節(jié)dl-MoS2對pH的響應(yīng)范圍。
　　3、在MoS2量子點表面修飾上線粒體靶向基團三苯基膦和pH響應(yīng)的LA-RhB配體，開發(fā)出了線粒體靶向pH響應(yīng)比率熒光探針（mito-MoS2）。mito-MoS2中MoS2量子點的熒光強度不隨pH變化而變化，在比率熒光探針中作為熒

8、光參照。細胞器共定位實驗顯示：mito-MoS2在線粒體上共定位的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.856，而在溶酶體上共定位的皮爾森相關(guān)系數(shù)僅為0.259。這些結(jié)果表明mito-MoS2能靶向的在線粒體內(nèi)富集。通過雙激發(fā)雙發(fā)射熒光檢測模式，利用 mito-MoS2檢測了 Hela細胞線粒體的pH值，并對Hela細胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下線粒體pH變化進行了成像檢測，結(jié)果表明mito-MoS2探針可以對線粒體內(nèi)的pH進行實時成像檢測，并且能夠可視化的檢測線

9、粒體的酸化過程。
　　4、利用包裹介孔二氧化硅的聚離子液納米反應(yīng)器，開發(fā)出了具有核殼結(jié)構(gòu)的過氧化氫化學(xué)發(fā)光生物探針（c-PIL@SiO2）。聚離子液核具有特殊的親疏水性，由親水的帶電離子液部分和疏水的長烷烴鏈部分組成。其中疏水區(qū)用于裝載過氧化草酸酯和熒光染料。親水區(qū)則為生物質(zhì)環(huán)境中的過氧化氫提供了進入納米反應(yīng)器核芯的通道。外層的介孔二氧化硅殼層為該化學(xué)發(fā)光探針提供了必要的機械穩(wěn)定性并維持其在生物體系中的分散性。c-PIL@SiO2

10、粒徑在100 nm左右，激光共聚焦細胞成像結(jié)果表明c-PIL@SiO2能在5 min內(nèi)順利進入RAW264.7細胞。而過氧化草酸酯和熒光染料裝載進納米反應(yīng)器后，化學(xué)發(fā)光動力學(xué)發(fā)生了改變，化學(xué)發(fā)光時間得以延長。這些特點使得在c-PIL@SiO2無損地進入細胞后，能夠順利地檢測到雙氧水的化學(xué)發(fā)光信號。我們進一步利用c-PIL@SiO2，通過小動物成像系統(tǒng)對小鼠的關(guān)節(jié)炎模型進行檢測，實現(xiàn)了該納米反應(yīng)器在細胞和活體層面上的化學(xué)發(fā)光成像。PIL@