PEI修飾的納米佐劑增強結核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗效應的研究.pdf

1、結核病是由結核分歧桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性感染性疾病，目前仍然是威脅人類健康的主要感染性疾病之一，亦是世界上感染性疾病致死的主要病因。近年來，隨著人口流動的增加、多重耐藥菌株(mult-drug resistance，MDR-TB)的出現(xiàn)、MTB與人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)伴發(fā)感染的發(fā)生，以及傳統(tǒng)的結核病疫苗-卡介苗(Baci

2、llus Calmette Guerin，BCG)接種防護的自身局限性，即僅對兒童有一定保護作用，但不能有效預防成人結核桿菌的感染，導致結核病的發(fā)生率在全球呈上升趨勢。
　　眾所周知，BCG在降低兒童原發(fā)性結核、結核性腦膜炎、粟粒性肺結核的發(fā)生方面發(fā)揮了重要作用，但對成人結核病預防作用，其免疫保護效果存在顯著差異（保護率0％～80％），并且艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)患

3、者接種BCG后可引起全身播散性感染，且發(fā)病后治療困難，病死率高，鑒于BCG的這些不足，研制新型疫苗控制結核病更為緊迫。
　　本實驗室在前期的研究中，構建了結核桿菌Ag85A-ESAT-6(6-kDa early secretoryantigen target)融合基因與IL-21共表達的DNA疫苗，通過肌肉注射的途徑免疫實驗動物，顯示了一定的免疫效應，但對實驗動物預防結核桿菌感染的效果仍未達到或超過傳統(tǒng)結核病疫苗-BCG。針對這一

4、狀況和當前結核疫苗研究存在的問題，本課題旨在原有的基礎上，設計新型DNA疫苗，即選用聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)表面修飾的Fe3O4納米材料作為佐劑，以增強Ag85A-ESAT-6與IL-21共同表達的DNA疫苗的免疫原性，增強免疫鼠在結核桿菌攻擊后的預防及正常鼠受結核菌感染后的治療效果，以期篩選出優(yōu)于BCG的結核預防和治療性納米佐劑增強型的DNA疫苗，并用于臨床前研究，為最終研制高效價廉安全的結核疫苗奠定試驗

5、基礎。
　　目的：
　　探討聚乙烯亞胺(PEI)修飾的Fe3O4納米顆粒負載的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗的免疫效應及對免疫鼠防治結核桿菌的保護性效果。
　　方法：
　　1.首先采用PEI修飾的Fe3O4納米顆粒作為佐劑，制備新型的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)并對其表征，隨后檢測該疫苗能否有效轉染進細胞表達靶抗原Ag85A-ES

6、AT-6和IL-21蛋白。
　　2.將PEI修飾的Fe3O4納米顆粒負載的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)，與單表達結核桿菌融合靶抗原(Ag85A-ESAT-6)的pIRES-Ag85A-ESAT-6DNA疫苗(PAE)和共同表達Ag85A-ESAT-6與IL-21的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗(PAEI)分別接種C57BL/6小鼠三次，再用結核桿菌攻

7、擊小鼠，觀察新型DNA疫苗對小鼠的保護性效應。
　　3.通過不同的免疫學和病理學方法，分析新型Np-PAEI DNA疫苗及其不同對照組疫苗誘導小鼠產生針對結核桿菌的細胞免疫和體液免疫及免疫病理反應。
　　4.采用PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗與BCG聯(lián)合采用初免-促免（序-貫）策略免疫小鼠，并觀察免疫小鼠對抗結核分枝桿菌感染的保護性作用。
　　5.采用標準有毒株H37Rv結核桿菌以氣溶膠霧化吸入方式攻擊小鼠，成

8、功復制結核病感染模型，再用PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗接種治療，并與BCG免疫治療相比較，觀察新型DNA疫苗對小鼠結核桿菌感染的治療效應。
　　結果：
　　1.PEI修飾的PAEI質粒疫苗可以被有效吸附到Fe3O4納米顆粒表面，并在透射電鏡下顯示良好的形態(tài)。Zeta電位分析顯示，在pH在7.2-7.4范圍內，吸附了PAEI質粒疫苗的Np-PAEI的Zeta電位為36mV左右，與細胞內環(huán)境相符合。PEI修飾的Np-P

9、AEI納米顆粒疫苗不僅能被有效的轉染進B16F10細胞內，而且該疫苗不會明顯影響所轉染細胞的繁殖和生長。RT-PCR和Western blotting結果提示，新型Np-PAEI DNA疫苗在細胞內可以正確的表達Ag85A-ESAT-6靶抗原以及IL-21蛋白。
　　2.相比較于單獨的PAE DNA疫苗和PAEI DNA疫苗，PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗顯著增強了小鼠針對結核分枝桿菌的保護效應，并且顯著抑制了小鼠體內的結

10、核分枝桿菌的生長，與不同對照疫苗組相比，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　3.在接種了不同DNA疫苗的小鼠體內都產生了針對結核分枝桿菌的免疫反應，特別是PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗免疫鼠，顯著增強的NK細胞、脾臟細胞和CD8+T細胞的殺傷效率;IFN-γ的分泌量和對Ag85A和ESAT-6的抗體量也明顯增加，與不同對照疫苗組相比，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　4.免疫病理結果顯示，PEI修飾的Np-

11、PAEI DNA疫苗免疫鼠，肺部結核結節(jié)和免疫病理損傷及脾臟轉移的結核病灶與不同對照疫苗組相比，均明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　5.與BCG免疫治療相比較，PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗能產生增強的小鼠抗結核桿菌感染的治療效應，體現(xiàn)在肺部荷菌量減少及病理損傷減輕，小鼠體重增長相對加快。
　　結論：
　　研制的PEI修飾的Fe3O4納米顆粒負載的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21