基于免標記熒光生物傳感器檢測蛋白質和小分子的研究.pdf

1、生物傳感技術具有許多優(yōu)點諸如設備簡單、價格低廉、響應速度快和靈敏度高等，已經(jīng)在分析化學、生物化學、生物醫(yī)學和生物技術等領域中引起了人們的高度關注。其中，利用熒光信號作為檢測手段的熒光生物傳感器在基因測序、環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)藥等領域的應用引起了廣大科研工作者的廣泛興趣。蛋白質和小分子的檢測對疾病診斷、營養(yǎng)健康分析及臨床研究具有十分重要的意義。因此，對蛋白質和小分子等人體內(nèi)物質的分析一直是現(xiàn)代分析化學非常重要的研究課題。如何利用熒光生物傳感技術實

2、現(xiàn)對蛋白質和小分子快速、靈敏和精確的檢測仍是生物醫(yī)學和分析化學工作者的追求。本文基于當前的研究現(xiàn)狀，結合信號放大技術，使用熒光染料作為標記物發(fā)展了一些新的熒光生物傳感技術，實現(xiàn)了對蛋白質和小分子的高靈敏檢測，研究內(nèi)容具體如下:
　　1.基于酶催化目標物循環(huán)放大誘導發(fā)卡適體結構的改變構建免標記熒光傳感器靈敏檢測ATP在本實驗中，我們展示了一個新的免標記、簡單靈敏的熒光ATP檢測傳感器，該方法是基于核酸外切酶Ⅲ(Ⅲ酶)催化的目標物循環(huán)

3、放大(ECTR)策略，利用SYBR GreenⅠ作為熒光指示劑，在ATP存在時，發(fā)卡結構的適體鏈構型發(fā)生改變構建成新的發(fā)卡結構，該新構型將被Ⅲ酶水解，同時釋放出的目標物ATP引發(fā)下一個循環(huán)。如此目標物循環(huán)過程將水解大量的發(fā)夾結構適體探針，導致發(fā)夾結構莖部中SYBR GreenⅠ嵌入量的減少，熒光發(fā)射強度的急劇減少。該方法用于ATP的靈敏檢測，其檢測限可低至納摩爾級別。由于ATP和適體之間高效特異的親和力，該方法對于ATP的類似物分子展示

4、了非常好的選擇性。此外，該ATP檢測方案簡單穩(wěn)定，不需要標記適體探針，并且適用于均相檢測，使得其在檢測其他小分子方面具有很大的應用潛能。
　　2.基于小分子鏈接單鏈DNA的終端保護用于免標記熒光檢測葉酸受體在這個工作中，基于葉酸連接單鏈DNA的終端保護和熒光染料SYBR Gold，我們發(fā)展了一種免標記的熒光方法用于檢測葉酸受體。目標物葉酸受體和連接葉酸的單鏈DNA的結合可以保護該單鏈DNA不被核酸外切酶Ⅰ（Ⅰ酶）水解。受終端保護沒

5、有被水解的單鏈DNA與熒光染料SYBR Gold結合產(chǎn)生強烈的熒光，基于此檢測葉酸受體，檢測限能達到30pM。此外，該方法也展示了良好的選擇性，且避免了DNA探針的熒光標記。在以上優(yōu)點的驅動下，通過使用不同的小分子配體和蛋白質受體，該方法在檢測其他蛋白質方面具有很大的應用潛能。
　　3.基于Toehold鏈置換引發(fā)G-四鏈體DNA組裝的非酶免標記熒光檢測凝血酶基于一種新的信號放大技術即toehold鏈置換引發(fā)G-四鏈體DNA循環(huán)組

6、裝，我們發(fā)展了一種免標記的非酶傳感器用于高靈敏的熒光檢測凝血酶。目標物凝血酶能夠和其相應的適體結合并且釋放出作為引發(fā)序列的單鏈DNA，該引發(fā)序列能夠引發(fā)兩端含有封閉G-四鏈體結構的發(fā)夾探針的toehold鏈置換，導致DNA組裝，且兩端形成G四鏈體結構。toehold鏈置換的反應導致引發(fā)序列的循環(huán)再使用并且產(chǎn)生許多含有G-四鏈體結構的DNA雙鏈。熒光染料NMM能夠特異性的和G-四鏈體結構結合并且釋放出強烈的熒光信號。我們的實驗能夠非常靈敏