基于功能化納米材料構(gòu)建的同一界面單組分及多組分檢測(cè)的電流型免疫傳感器的研究.pdf

1、生物標(biāo)志物在癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和篩查，精確預(yù)判和癥狀診斷，評(píng)估生物治療效果方面發(fā)揮著愈加重要的作用。基于電化學(xué)技術(shù)的生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)以其經(jīng)濟(jì)、快速、易量化等優(yōu)勢(shì)引起了研究者廣泛的關(guān)注。電流型免疫傳感器是將生物活性材料固載在電極表面，檢測(cè)抗體-抗原反應(yīng)引起的電流變化，已被證明是一種靈敏、快速和低成本且高效的定量方法。電化學(xué)免疫傳感器的制備過程中，一個(gè)關(guān)鍵的步驟是固定生物分子在檢測(cè)敏感界面上，如今各種各樣的納米材料在傳感器構(gòu)造和性能提升中起到越

2、來越大的作用。本文在新型的復(fù)合納米材料用于電流型免疫傳感器的構(gòu)建以及多組分同時(shí)檢測(cè)技術(shù)方面進(jìn)行了一系列探索性的研究。具體研究工作如下:
　　1.以金-鉑合金和鐵氰化鎳納米粒子及辣根過氧化物酶納米粒子構(gòu)建的電流型免疫傳感器的研究
　　利用金-鉑合金納米粒子(Au-PtNPs)、鐵氰化鎳納米粒子（NiHCFNPs）和過氧化物酶納米粒子(HRPNPs)的優(yōu)點(diǎn)來制備一個(gè)簡(jiǎn)單、高度敏感、穩(wěn)定的甲胎蛋白(AFP)免疫傳感器。首先，Au-

3、PtNPs被電沉積在玻碳電極(GCE)上，然后NiHCFNPs通過金氰鍵組裝到Au-PtNPs表面。隨后，第二層Au-PtNPs沉積，抗AFP通過氨基和巰基與Au-PtNPs反應(yīng)結(jié)合，最后，HRPNPs作為封閉試劑被固載。在這個(gè)方案中，NiHCFNPs提供了極好的氧化還原峰以進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，并且非常穩(wěn)定，電學(xué)信號(hào)強(qiáng)。Au-PtNPs和HRPNPs協(xié)同催化作用H2O2可以極大的放大響應(yīng)信號(hào)。采用HRPNPs代替HRP作為催化和封閉物質(zhì)，可以

4、在有限的結(jié)合位點(diǎn)加載上更多的HRP分子利于提高響應(yīng)信號(hào)。此外，由于制備方法非常簡(jiǎn)單，采用的納米材料較為穩(wěn)定，提高了免疫傳感器的穩(wěn)定性。
　　2.以金-鎳復(fù)合納米材料作為催化試劑的新型豬鏈球菌2型免疫傳感器
　　傳統(tǒng)的豬鏈球菌2型(SS2)檢測(cè)方法大多比較費(fèi)時(shí)，成本較高且需要較高專業(yè)培訓(xùn)的人員。因此，我們?cè)噲D發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的電化學(xué)傳感器來檢測(cè)SS2。鐵氰化鎳中的CN-易于與貴金屬離子如金離子絡(luò)合，這一特性可用于制備金

5、-鎳納米復(fù)合材料，此方法只需要混合攪拌，不需加入其它試劑，具有簡(jiǎn)單、綠色的特點(diǎn)。為了構(gòu)建生物傳感器，金納米粒子（AuNPs）通過簡(jiǎn)單的恒電位電化學(xué)沉積到玻碳電極的表面上作為電極基底，然后結(jié)合蛋白A(PA)，利用蛋白A的定向結(jié)合作用固載捕獲抗體(Ab1)。結(jié)合抗原后，與Au-Ni納米復(fù)合物結(jié)合檢測(cè)抗體(Ab2)形成夾心免疫結(jié)構(gòu)。信號(hào)放大來自于納米材料的增強(qiáng)效應(yīng)以及Au-Ni納米復(fù)合物對(duì)抗壞血酸(AA)強(qiáng)烈的催化作用。該免疫傳感器具有制備簡(jiǎn)

6、單，操作簡(jiǎn)便和成本低廉的特點(diǎn)。
　　3.同一種生物敏感界面中同時(shí)檢測(cè)三種抗原的以功能化的石墨烯及氧化還原探針為基礎(chǔ)的免疫傳感器的研究
　　基于氧化還原探針標(biāo)記的多組分檢測(cè)技術(shù)，為構(gòu)建簡(jiǎn)單而敏感的可同時(shí)測(cè)定三種抗原的電流型傳感器，三種捕獲抗體甲胎蛋白(anti-AFP)，胚胎抗原(anti-CEA)和豬鏈球菌(anti-SS2)被同時(shí)固定到蛋白A/萘酚(PA/Nafion)膜修飾的玻碳電極上;三種二抗則先與不同的氧化還原探針交

7、聯(lián)，再通過金納米粒子和羧基的固載作用結(jié)合到苝四甲酸/金/石墨烯（PTCA/Au/GS）納米復(fù)合物上，作為檢測(cè)信號(hào)標(biāo)簽和放大介質(zhì)。這種方法特點(diǎn)包括:首先，PA的每個(gè)分子含有多個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個(gè)域都可以固定一個(gè)蛋白質(zhì)分子，使用PA/Nafion膜作為基底，不僅可以固載大量的一抗，也有益于降低系統(tǒng)的背景電流影響。其次，金納米粒子和羧基官能化的石墨烯可通過兩種結(jié)合方式分別結(jié)合二抗，可顯著增加二抗的固載量，極大的提高了示蹤物的信號(hào)強(qiáng)度。

8、在對(duì)三種生物標(biāo)志物AFP，CEA和SS2同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，制得的免疫電極表現(xiàn)出低的背景電流和出色的靈敏度，檢測(cè)范圍寬，檢測(cè)限低。
　　4.基于氧化還原探針標(biāo)記策略發(fā)展可在同一種生物敏感界面中同時(shí)檢測(cè)四種生物標(biāo)記物的免疫傳感器
　　在臨床診斷中，以單一標(biāo)記物的檢測(cè)來判斷癌癥通常是不可靠的，多種標(biāo)記物測(cè)量已被證明是提高診斷可靠性的有效方法。本文提出了基于氧化還原探針標(biāo)簽的同時(shí)同一界面測(cè)定四種生物標(biāo)志物的生物傳感器。為了實(shí)現(xiàn)這一

9、目標(biāo)，采用了四種氧化還原探針，包括蒽醌-2-羧酸(Aq)，硫堇(Thi)，聯(lián)吡啶鈷(Co)和羧基二茂鐵(Fc)，這些標(biāo)簽峰間電位大，重疊很小。在夾心免疫模式中，金納米粒子電沉積在玻碳電極(GCE)表面，結(jié)合四種捕獲抗體;四種檢測(cè)抗體先標(biāo)記不同的氧化還原探針，再結(jié)合在經(jīng)過3，4，9，10-苝四甲酸(PTCA)和聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)改性的碳納米管(CNT)表面的金納米粒子上，并充當(dāng)示蹤物。當(dāng)使用胚胎抗原(CEA)，糖蛋白CA1

10、25，CA19-9和CA242作為分析模型，制備的免疫傳感器顯示出低的背景電流，較好的靈敏度和選擇性。
　　5.基于雜交鏈反應(yīng)和生物素-鏈霉親和素信號(hào)放大策略實(shí)現(xiàn)高靈敏的同時(shí)檢測(cè)四種生物標(biāo)記物
　　各種各樣的納米材料如今在傳感器構(gòu)建和性能提升中起到越來越大的作用。其中，石墨烯(GS)和GS-Au一步法共沉積技術(shù)引起了較大的關(guān)注，其過程簡(jiǎn)單、快捷、環(huán)保。GS表面擁有的氧官能團(tuán)為成核提供了反應(yīng)部位，金納米粒子可以均勻地生長(zhǎng)于GS

11、的表面而不會(huì)凝聚。雜交鏈反應(yīng)(HCR)可用于增加各種傳感器信號(hào)的標(biāo)記的數(shù)量。在這項(xiàng)研究中，GS-Au復(fù)合納米材料，HCR和生物素/鏈霉親和素(B/SA)三種信號(hào)放大方法被采納以協(xié)同提高該多分析物免疫傳感器的響應(yīng)性能。此外，磁性納米材料的使用為Ab2復(fù)合物的制備和分離提供了極大的便利。當(dāng)使用四種代表性的生物標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)，胚胎抗原(CEA)，前列腺特異性抗原(PSA)和糖抗原(CA)125為待測(cè)物，制得的免疫傳感器表現(xiàn)出較寬的檢