光照對桔青霉生長發(fā)育和美伐他汀生物合成的影響.pdf

1、背景:
　　 光照作為外界環(huán)境改變的信號分子，可誘導包括絲狀真菌在內(nèi)的多種生物生長發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物的改變。在光照條件下，構巢曲霉(Aspergillusnidulans)合成次級代謝產(chǎn)物柄曲霉素的產(chǎn)量下降，并主要以無性繁殖的方式進行增殖，即使是在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上。研究表明調(diào)控蛋白VeA在構巢曲霉對光照的應答過程中起到了關鍵作用。在黑暗條件下，調(diào)控蛋白VeA可與VelB結合形成二聚體的形式協(xié)助其VelB進入細胞核內(nèi);進入細胞核

2、內(nèi)的VeA-VelB二聚體能對構巢曲霉的有性繁殖進行調(diào)控;同時VelB-VeA還能與LaeA結合形成Vlevet異源三聚復合物對次級代謝產(chǎn)物合成進行調(diào)控;與VeA解離后的VelB與VosA結合形成VosA-VelB異源二聚體可抑制無性繁殖。VeA參與光信號傳導系統(tǒng)的同時其自身的合成和向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程又受到光照的抑制，所以光照可以通過對VeA的抑制引起發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物的改變。調(diào)控蛋白VeA的功能不僅受到光照的影響，在黑暗條件下還受到

3、細胞核內(nèi)LaeA的調(diào)控。隨后，在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、粗糙脈胞菌（Neurosporacrassa）和產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）等多種真菌中均發(fā)現(xiàn)veA和laeA的同源基因具有類似的調(diào)控功能。
　　 桔青霉作為ML-236B（美伐他汀、康泊?。┕I(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)生菌株，對其生物合成分子機制的探究具有重要意義。實驗室從桔青霉中已克隆得到veA和laeA的同源基因pciveA和p

4、cilaeA。桔青霉中的pciveA和pcilaeA是否也具有如構巢曲霉中VeA和LaeA類似的功能，對ML-236B合成基因簇途徑特異性調(diào)控因子mlcR起到相似的調(diào)控作用值得研究。
　　 目的:
　　 本課題通過比較光照和黑暗條件下桔青霉生長發(fā)育表型，次級代謝產(chǎn)物ML-236B生物合成的差異，研究兩種條件下桔青霉光照調(diào)控基因pciveA、pcilaeA和途徑特異性調(diào)控基因mclR的表達量變化。旨在初步探討光調(diào)控桔青霉生

5、長發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物合成的機制。
　　 方法:
　　 1.插片法觀察光照與黑暗對照培養(yǎng)條件下桔青霉在固體培養(yǎng)基上生長過程、產(chǎn)分生孢子和色素的情況。
　　 2.光照和黑暗兩種條件下發(fā)酵桔青霉IMB002，研究光照對發(fā)酵液中桔青霉菌體生長、葡萄糖消耗和主要次級代謝產(chǎn)物ML-236B產(chǎn)量的影響。
　　 3.通過RT-qPCR的方法，分析光照和黑暗條件下發(fā)酵的桔青霉中與光應答有光的調(diào)控基因pciveA、pcila

6、eA及ML-236B生物合成途徑特異性調(diào)控基因mlcR的表達量變化情況。
　　 4.通過農(nóng)桿菌LBA4404介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系構建桔青霉pcilaeA高表達突變菌株，并通過HPLC檢測突變菌株發(fā)酵產(chǎn)物的變化情況。
　　 結果:
　　 1.光照培養(yǎng)條件下的桔青霉產(chǎn)生的分生孢子和累積的色素都明顯較黑暗條件下的多;顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)黑暗條件下桔青霉IMB002分生孢子梗結構發(fā)育不完整，難以形成成熟的分生孢子;將長時間處于黑

7、暗培養(yǎng)條件下的桔青霉IMB002轉(zhuǎn)移至有光照的地方，經(jīng)過光照誘導，可以恢復其正常產(chǎn)孢和累積色素的能力。
　　 2.光照條件下桔青霉IMB002對葡萄糖的利用較黑暗條件下快;在發(fā)酵前期桔青霉IMB002在光照培養(yǎng)條件下的菌體干重較黑暗條件下高;光照培養(yǎng)條件下累計的ML-236B始終低于黑暗條件下合成的量。
　　 3.經(jīng)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)桔青霉IMB002中pciveA、pcialeA、mclR基因以pgk基因為內(nèi)參，在

8、光照條件下的表達量相比黑暗條件下的均較低。mlcR在發(fā)酵前期和后期相對黑暗條件下的表達量幾乎不變，所以在光照和黑暗條件下的桔青霉IMB002都能以相對穩(wěn)定的增長速率累積ML-236B。發(fā)酵后期pciveA和pcilaeA在光照條件下的相對表達量較發(fā)酵前期有所提高，與光照在發(fā)酵后期可以持續(xù)累計ML-236B的趨勢是一致的。黑暗條件下，發(fā)酵后期ML-236B的合成進入平臺期，可能是大量合成的次級代謝產(chǎn)物反饋性抑制了MlcR的功能。
　

9、　 4.野生型桔青霉ATCC38065和pcialeA高表達菌株Penicilliumcitrinum::pcilaeA(CDS)分別在ML-236B高產(chǎn)培養(yǎng)基中發(fā)酵，用HPLC檢測其甲醇浸提的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)pcilaeA高表達菌株中ML-236B的合成量有明顯提高，同時還有新峰的產(chǎn)生。
　　 結論:
　　 光照對桔青霉生長發(fā)育有明顯的影響，光照能夠促進分生孢子的形成和色素的累積，對前期ML-236B的合成也有抑制。通