耐鹽橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1社會行為對海洋生境適應(yīng)的分子策略.pdf

1、粘細菌是研究細菌社會行為的良好模式材料，其社會行為主要表現(xiàn)在滑動運動、攝食和多細胞協(xié)調(diào)發(fā)育過程，而滑動運動在細胞攝食和子實體發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用。黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)的滑動運動由兩個獨立的遺傳系統(tǒng)調(diào)控：一個是A運動系統(tǒng)，主要調(diào)控獨立的單個細胞運動；另一個是S運動系統(tǒng)，主要調(diào)控群體細胞運動。S運動系統(tǒng)主要包括三個組分：IV型菌毛、細胞外基質(zhì)和O-抗原。黃色粘球菌的運動調(diào)控系統(tǒng)非常復雜，迄今為止，發(fā)現(xiàn)

2、的S運動系統(tǒng)相關(guān)基因己超過110個。 二十世紀末以前，粘細菌被普遍認為是典型的土壤微生物，分離的陸生菌株不能夠在高于1％的鹽濃度條件下生長。而從1998年日本學者在海洋樣品中分離到嗜鹽粘細菌以來，越來越多的粘細菌從多種海洋環(huán)境中分離純化出來。根據(jù)耐鹽能力的不同，海洋粘細菌被分為兩類：海洋嗜鹽粘細菌和海洋耐鹽粘細菌。 海洋嗜鹽粘細菌主要是由日本學者分離到的，根據(jù)形態(tài)學特征和16S rDNA的分析，這些菌株被歸為四個新的屬。

3、他們對海洋嗜鹽粘細菌的研究主要集中在形態(tài)學分析、分類以及抗生素等代謝產(chǎn)物分析方面，而關(guān)于粘細菌在海洋生境中的生活模式、定殖機制及更深入的分子機制等方面一直都沒有涉及。 本實驗室經(jīng)過多年的探索，從海洋樣品中分離到了多株海洋耐鹽粘細菌。前期實驗中，將其中的橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1菌株作為一株典型的耐鹽粘細菌模式菌株，與其它耐鹽粘細菌或嗜鹽粘細菌對比，對其形態(tài)學、生理學和系統(tǒng)分類學等特征及運動和發(fā)育能力進

4、行了詳細的分析。揭示了海洋耐鹽粘細菌在陸地和海洋生境下存在兩種不同的生活模式；并由實驗結(jié)果推測海洋耐鹽粘細菌是陸生粘細菌被帶到海洋生境中適應(yīng)了海水環(huán)境而存活下來，即海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1生活在海洋生境中是適應(yīng)進化的結(jié)果。并且發(fā)現(xiàn)，在海水條件下，海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1不僅保留了雙運動系統(tǒng)，且雙運動能力尤其是S運動能力明顯增強。S運動的增強可能促進細胞間的粘連，為更好的適應(yīng)海洋生境提供條件，證明社會運

5、動在海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1適應(yīng)海洋生境生存過程中發(fā)揮著非常重要的作用。探知自然生境下粘細菌運動系統(tǒng)的多樣性和對環(huán)境的適應(yīng)可能為我們理解粘細菌運動系統(tǒng)的形成和進化提供重要線索。 mariner轉(zhuǎn)座因子是來自真核生物的mariner/Tcl超家族的成員，與原核生物的轉(zhuǎn)座子如Tn5相比，有著多種獨特的性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)簡單、轉(zhuǎn)座作用不依賴宿主的特定因素和隨機插入等，這些特性使其在自然界中廣泛分布，并可在物種間水平轉(zhuǎn)移。目前

6、，已有多篇文獻報道m(xù)ariner轉(zhuǎn)座因子可以在粘細菌中有效地轉(zhuǎn)座，并且達到穩(wěn)定整合，是粘細菌遺傳研究的有力工具之一。 本研究以海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1為材料，建立了一整套適合耐鹽粘球菌的分子遺傳操作體系，為開展耐鹽粘細菌運動和發(fā)育等細胞行為的分子遺傳學研究搭建了基礎(chǔ)平臺；在此基礎(chǔ)上，利用mariner類轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ構(gòu)建了HW-1菌株的小型隨機插入突變菌庫，從中發(fā)現(xiàn)并深入研究了一個社會運

7、動和發(fā)育相關(guān)的新基因簇mts，該結(jié)果不僅擴充了粘球菌社會運動和發(fā)育相關(guān)基因文庫，彌補了在模式菌株DK1622中篩選失活后對運動僅有微弱影響基因困難的不足，為粘球菌運動基因的篩選提供了新途徑和新思路，而且開啟了在分子水平上研究海洋耐鹽粘細菌社會行為對海洋生境適應(yīng)機制的大門，為理解HW-1社會行為對海洋生境適應(yīng)的分子機制提供了重要依據(jù)。 實驗中，為了研究與M.fulvus HW-1適應(yīng)海洋生境相關(guān)的S運動系統(tǒng)基因，首先將marine

8、r·類轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ電轉(zhuǎn)化入M.fulvus HW-1細胞，通過隨機插入突變的方法建立了M.fulvus HW-1菌株的隨機突變菌庫，從中篩選到一株社會運動缺陷突變株M.fulvus HL-1利用報告基因lacZ的表達驗證了突變株HL-1染色體上插入了轉(zhuǎn)座子MirfiHimarl-lacZ，并且發(fā)現(xiàn)突變基因表達時間很早、表達水平很高。 雙運動能力分析的經(jīng)典方法--“軟硬瓊脂方法”分析結(jié)果顯示：突變株M.fu

9、lvus HL-1 S運動能力缺陷，A運動能力受到影響；且令人興奮的是，該突變株在海水條件下運動能力增強的趨勢明顯減弱、甚至消失，證明突變株M。fulvus HL-1中的突變基因在海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1在海水條件下S運動能力增強行為中發(fā)揮著重要的作用。通過發(fā)育平板上發(fā)育能力的檢測證明了突變株M.fulvus HL-1的子實體形成和粘孢子發(fā)育能力缺陷。分析S運動系統(tǒng)的重要組分細胞外基質(zhì)的染料結(jié)合實驗、聚集實驗和掃描電

10、鏡觀察實驗結(jié)果充分證明了突變株M.fulvus HL-1細胞外基質(zhì)數(shù)量減少，細胞粘連性降低。這些實驗結(jié)果表明：突變株M.fulvus HL-1中的突變基因可能在M.fulvus HW-1社會行為(運動和發(fā)育)中、甚至在社會行為對海洋生境適應(yīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。 通過質(zhì)粒營救法和Tail-PCR方法獲得了突變株M.fulvus HW-1中轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ插入位點兩側(cè)13 kb序列。通過ORF分析軟件Fr

11、amePlot 3.0beta分析預測該片段編碼6個功能相關(guān)的同向轉(zhuǎn)錄ORFs。Genbank上BLASTX比對結(jié)果表明：在黃色粘球菌Myxococcus xanthus DK1622和粘細菌中與粘球菌同亞目的另一個菌株橙色標樁菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1基因組上，均有該6個ORFs的高度同源基因，且中間4個ORFs及其在DKl622和DW4/3-1中的同源ORFs都與主要來自真核生物的、與細胞的粘附、

12、運動和增殖等多種細胞行為密切相關(guān)的Thrombospondin type 3 repeat家族蛋白同源。因此該基因簇被命名為mrs(意指(_m)yxobacterial (_t)hrombo(_s)pondin-like)，分別編碼MtsA、MtsB、MtsC、MtsD、MtsE和MtsF蛋白。在突變株HL-1中，轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ插入在ORF mtsC的3’末端。結(jié)構(gòu)域預測軟件SMART分析結(jié)果顯示：MtsA和Mts

13、E N端均有一個穿膜結(jié)構(gòu)域，MtsD和MtsE均具有通常在細胞粘連等行為中發(fā)揮著重要作用的VWA[von Willebrand factor (vWF)type A domain]結(jié)構(gòu)域。 通過菌落擴展能力的分析比較證明了mtsC同源基因的插入失活對M.xanthus DK1622運動能力的影響遠低于mtsC插入失活對M.fulvus HW-1運動能力的影響。該結(jié)果與PHX(predicted highly expressed)

14、分析軟件預測的mts及其同源基因表達水平結(jié)果一致，說明與mtsC同源基因在陸生粘球菌M.xanthus DK1622運動過程中發(fā)揮的作用相比，mtsC在海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1運動過程中發(fā)揮的作用更重要，即mtsC甚至整個mts基因簇可能在M.fulvus HW-1社會行為對海洋生境適應(yīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。通過mtsC同源基因缺失突變及與已知A和S運動基因分別構(gòu)建的雙基因突變的分析，證明了mtsC同源基因?qū)儆赟運

15、動系統(tǒng)基因，在M. xanthus DK1622的S運動和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。mts同源基因簇的缺失證明mts同源基因簇可能在M. xanthus DK1622的S運動和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。 通過其它mts同源基因缺失的分析證明了mtsA，mtsB、mtsD、mtsE和mtsF同源基因均在M.xanthus DK1622的S運動中發(fā)揮著重要的作用；而除mtsF外，mtsA、mtsB、mtsD和mtsE同源基因也均

16、在M.xanthus DK1622的子實體形成和粘孢子發(fā)育過程中占有重要的地位。 為了在粘球菌中對MtsB同源蛋白進行細胞定位，構(gòu)建了熒光蛋白與MtsB同源蛋白融合表達菌株，但在該菌株細胞中沒有檢測到熒光。通過lacZ報告基因的分析顯示了融合蛋白能夠表達，但不能正常發(fā)射熒光。 在大腸桿菌中，異源表達了MtsB及其同源蛋白MXAN1333。通過表達細胞破碎液離心后沉淀和上清液中蛋白的分析確認了表達的融合蛋白MtsB和MXA

17、Nl333多數(shù)都呈包涵體形式。提取、純化了融合蛋白MtsB和MXAN1333，并制備了融合蛋白MtsB和MXAN1333的多克隆抗體，為MtsB及其同源蛋白的細胞定位和表達時間譜等功能機制分析奠定了堅實的基礎(chǔ)。 通過紫外誘變對M.fulvus HW-1進行了改造，獲得了一株在液體培養(yǎng)基中均勻穩(wěn)定分散生長誘變株M.fulvus UV684。對UV684進行了形態(tài)學特性、耐鹽能力和運動能力的分析，顯示了分散生長對粘球菌的營養(yǎng)細胞和粘