仿生礦化制備負(fù)載阿霉素靶向納米羥基磷灰石的研究.pdf

1、納米羥基磷灰石(nano-Hydroxyapatite，簡(jiǎn)稱(chēng)nano-HA)是人體硬組織的主要無(wú)機(jī)成分，具有良好的生物相容性和生物活性，作為骨替換材料和藥物載體已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床。然而，傳統(tǒng)的合成方法很難精確控制nano-HA的形貌、尺寸、取向和結(jié)晶度，其生物相容性和骨傳導(dǎo)性與自然骨中nano-HA仍有一定差異。明膠是膠原水解后的產(chǎn)物，具有18種氨基酸，化學(xué)成分與膠原相似，且來(lái)源廣泛，可以代替非膠原蛋白和膠原蛋白為礦物形核提供位點(diǎn)。因此

2、，本論文的目的是采用仿生礦化的方法，利用明膠仿生制備與自然骨更為相似的nano-HA，同時(shí)接枝葉酸(Folic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)FA)實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向性，并研究?jī)煞N不同方式負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin，簡(jiǎn)稱(chēng)DOX)的包封率和藥物釋放動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)靶向給藥和緩解藥物突釋。負(fù)載阿霉素靶向nano-HA可主動(dòng)靶向作用于腫瘤細(xì)胞，提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，從而更好的滿(mǎn)足臨床需求。
　　采用仿生礦化方法制備nano-HA，首先加入

3、一定量的明膠，質(zhì)量分別為理論合成nano-HA質(zhì)量的0％、20％、40％、60％、80％和100％，研究不同明膠含量對(duì)nano-HA尺寸、形貌、取向和結(jié)晶性的影響、明膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化、生成物中明膠所占比例。結(jié)果表明，隨著明膠含量的增大，粒子尺寸由150 nm逐漸減小到50 nm，形貌由不規(guī)則球狀轉(zhuǎn)變?yōu)獒槹魻睿琧軸取向性在明膠含量為80％時(shí)達(dá)到最大，結(jié)晶性逐漸變?nèi)?。生成物中的明膠含量逐漸增多，受到Ca2+的影響，明膠二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊所占

4、比例隨著明膠含量的增加而增加，當(dāng)明膠含量為80％時(shí)達(dá)到最大值。與其它二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)暴露出的殘留氨基酸最多，即提供的形核位點(diǎn)最多，且氨基酸和氨基酸的間距接近于nano-HA沿c軸取向時(shí)Ca2+和Ca2+之間的距離，因此c軸取向性逐漸增強(qiáng)，在明膠含量為80％時(shí)達(dá)到最大。
　　選用聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，簡(jiǎn)稱(chēng)PEI）對(duì)nano-HA表面進(jìn)行修飾并接枝葉酸，實(shí)現(xiàn)粒子的主動(dòng)靶向性，利用不同載藥方式負(fù)載抗

5、腫瘤藥物阿霉素:①先制備nano-HA，接枝葉酸，在物理吸附阿霉素，所得產(chǎn)物命名為:HA-X％Gel-FA-DOX;②nano-HA形核過(guò)程中加入阿霉素，然后接枝葉酸，所得產(chǎn)物HA-X％Gel-DOX-FA。結(jié)果表明，隨著明膠含量的增加，葉酸接枝率由31.18％增加到43.86％，明膠含量為80％時(shí)達(dá)到最大值，然后又下降到39.45％。先接枝葉酸，然后負(fù)載阿霉素，阿霉素包封率由8.62％上升到41.18％;在nano-HA-80％Gel

6、合成過(guò)程中加入阿霉素，此時(shí)阿霉素包封率達(dá)到57.92％，然后接枝葉酸，其枝率為43.12％。其原因是①合成nano-HA-80％Gel中加入阿霉素，nano-HA-80％Gel除了表面吸附阿霉素，阿霉素會(huì)被包裹在nano-HA-80％Gel內(nèi)部，從而提高了阿霉素包封率;②阿霉素含有羥基(-OH)，合成nano-HA-80％Gel過(guò)程中加入阿霉素，阿霉素上的-OH吸附Ca2+，Ca2+在吸附PO43-和-OH，nano-HA-80％Gel

7、生長(zhǎng)過(guò)程中與阿霉素存在化學(xué)鍵作用，從而HA-80％Gel-DOX-FA的阿霉素包封率遠(yuǎn)大于HA-X％Gel-FA-DOX。藥物釋放動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，HA-80％Gel-DOX-FA的藥物釋放速度明顯慢于HA-FA-DOX和HA-80％Gel-FA-DOX, pH=7.4、240 h時(shí)，HA-80％Gel-FA-DOX和HA-80％Gel-DOX-FA釋放量分別為83.9％和50.4％。pH=5.8、240 h時(shí)，HA-FA-DOX藥物全部

8、釋放，HA-80％Gel-DOX和DOX-HA-80％Gel-DOX-FA釋放量分別為87.36％、51.32％。在酸性條件下，藥物釋放更快，其原因是在酸性條件下，nano-HA會(huì)溶解，吸附在nano-HA上的藥物會(huì)更快釋放出來(lái)。
　　將 nano-HA、 nano-HA-80％Gel、阿霉素、HA-80％Gel-FA-DOX、HA-80％Gel-DOX-FA分別與巨噬細(xì)胞和肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)各組樣品對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性和肝癌細(xì)

9、胞的抑制率。倒置顯微鏡和熒光染色結(jié)果表明:共培養(yǎng)1、3、5d后，nano-HA和nano-HA-80％Gel共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體態(tài)良好，形狀為球形，阿霉素有較大的毒性，使巨噬細(xì)胞凋亡，HA-80％Gel-FA-DOX、HA-80％Gel-DOX-FA可降低阿霉素毒性，巨噬細(xì)胞凋亡得到緩解;nano-HA和nano-HA-80％Gel對(duì)肝癌細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，HA-80％Gel-FA-DOX和HA-80％Gel-DOX-FA

10、均可靶向作用于肝癌細(xì)胞，但HA-80％Gel-DOX-FA靶向作用更強(qiáng)。MTT檢測(cè)結(jié)果表明:nano-HA和nano-HA-80％Gel對(duì)巨噬細(xì)胞有良好的生物相容性，HA-80％Gel-FA-DOX和HA-80％Gel-DOX-FA細(xì)胞毒性為2級(jí)，可有效降低DOX的細(xì)胞毒性。HA-80％Gel-DOX-FA對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，表明在nano-HA-80％Gel合成過(guò)程中載藥，然后接枝葉酸可有效提高藥效和粒子靶向性。
　　本研