阿特拉津量熱傳感快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本項(xiàng)目以食品生產(chǎn)過(guò)程中典型農(nóng)藥污染物阿特拉津(ATZ)為靶標(biāo)，針對(duì)現(xiàn)有生物檢測(cè)方法因?qū)悠饭鈱W(xué)性質(zhì)要求高導(dǎo)致的樣品前處理復(fù)雜與檢測(cè)信號(hào)需要多次放大導(dǎo)致的檢測(cè)步驟繁瑣及儀器法中檢測(cè)設(shè)備昂貴等不足對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展的制約，通過(guò)建立新型量熱檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)加以克服。闡明熱信號(hào)轉(zhuǎn)換與調(diào)控機(jī)制，優(yōu)化流動(dòng)注射控制、熱信號(hào)采集與再生等系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)食品中農(nóng)藥殘留的樣品前處理簡(jiǎn)便、特異快速定量分析，為量熱傳感技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)、提供技術(shù)支持

2、。
　　本研究室成功構(gòu)建了針對(duì)典型三嗪類(lèi)農(nóng)藥殘留ATZ的量熱檢測(cè)方法體系。
　　1、基于固定化單克隆抗體的直接競(jìng)爭(zhēng)量熱檢測(cè)技術(shù)
　　首先對(duì)ATZ進(jìn)行羧基化修飾并采用碳二亞胺法與β-內(nèi)酰胺酶偶聯(lián)得到酶標(biāo)記的ATZ(ATZ-β)。另一方面，將純化得到的ATZ單克隆抗體(mAb)通過(guò)戊二醛法固定于固相載體-可控有孔玻璃球(CPG)上，并將其作為量熱調(diào)節(jié)器（恒溫裝置）中反應(yīng)柱填料，作為識(shí)別元件。
　　本方法選用β-內(nèi)酰胺

3、酶及青霉素G鈉為酶-底物對(duì)子進(jìn)行量熱檢測(cè)方法的建立。制備的ATZ-β，經(jīng)MALDI-TOF/MS鑒定，摩爾偶聯(lián)比為ATZ∶β-內(nèi)酰胺酶為2∶1。經(jīng)辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)ATZ腹水型單克隆抗體進(jìn)行純化。經(jīng)BCA蛋白定量法測(cè)定，純化后蛋白含量為2.8 mg mL-1。檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果為:ATZ-β0.25 mg mL-1（稀釋比為1∶10）、底物選用青霉素G鈉濃度，最佳使用濃度為16 mmol L-1。量熱體系流動(dòng)相流速優(yōu)化為800μl mi

4、n-1。再生液組分優(yōu)化為0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)，再生時(shí)間為10min。建立的直接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法，線性檢測(cè)范圍為0.7-3.9μg mL-1，檢出限為0.4μg mL-1。信號(hào)穩(wěn)定性良好，相同樣品連續(xù)上樣6次，信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在5％以?xún)?nèi)。該檢測(cè)方法僅對(duì)三嗪類(lèi)農(nóng)藥中西瑪津有明顯交叉反應(yīng)(36.4％)，認(rèn)為主要是由于兩者結(jié)構(gòu)高度類(lèi)似，后者僅比前者多一個(gè)甲基。

5、對(duì)于其它結(jié)構(gòu)類(lèi)似物未檢測(cè)到交叉反應(yīng)性。對(duì)分別以玉米秸稈及雙蒸水為基質(zhì)的樣品量熱信號(hào)比較發(fā)現(xiàn)，量熱檢測(cè)方法受基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。以新鮮玉米秸稈及玉米秸稈青儲(chǔ)為實(shí)樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。樣品僅需過(guò)濾與調(diào)整pH后即可進(jìn)樣。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)回收率在88％-107％之間，與高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。該量熱檢測(cè)方法信號(hào)響應(yīng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，樣品前處理簡(jiǎn)便。從加入待測(cè)樣品到加入酶特異性底物產(chǎn)生完整量熱信號(hào)需要時(shí)間約12 min。將進(jìn)樣

6、前本底信號(hào)的測(cè)定、產(chǎn)生量熱信號(hào)后的再生步驟及流動(dòng)相轉(zhuǎn)換為載液后基線的恢復(fù)所消耗的總時(shí)間計(jì)算在內(nèi)，一個(gè)樣品的檢測(cè)總時(shí)間約為45 min。固定化抗體柱可穩(wěn)定檢測(cè)約130-150樣品。使用完畢，反應(yīng)柱于4℃保存于載液內(nèi)或20％乙醇溶液內(nèi)。
　　建立的量熱檢測(cè)方法樣品前處理簡(jiǎn)單，信號(hào)響應(yīng)直觀快速，實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米秸稈樣品的加標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度滿(mǎn)足相關(guān)最大殘留量限量標(biāo)準(zhǔn)。本方法的建立，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)典型三嗪類(lèi)除草劑ATZ的

7、特異性、快速量熱檢測(cè)方法的建立。固定化抗體柱穩(wěn)定性好，可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)、快速農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，可以作為農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快篩查手段之一，在實(shí)際工作中推廣應(yīng)用。
　　2、基于ProteinG瓊脂糖凝膠的通用性量熱傳感技術(shù)研究
　　在建立方法一的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入離線孵育步驟與使用通用性識(shí)別元件構(gòu)建高靈敏、通用性量熱生物檢測(cè)技術(shù)。含有ATZ的待測(cè)樣品中加入一定量ATZ-β與mAb?；诟?jìng)爭(zhēng)法原理，在離線孵育條件下：37℃水浴，樣品混合液中A

8、TZ與ATZ-β競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mAb上的特異識(shí)別位點(diǎn)，形成抗ATZ-mAb和ATZ-β-mAb復(fù)合物。
　　本方法在重新計(jì)算投料量及投料比的基礎(chǔ)上，重新制備了ATZ-β。將MALDI-TOF/MS鑒定，摩爾偶聯(lián)比達(dá)到ATZ∶β-內(nèi)酰胺酶為11∶1。離線孵育條件為37℃30 min。樣品混合液中另需加入0.5％甘油，以增加蛋白表面水膜穩(wěn)定性，減少因其所致的非特異性吸附，進(jìn)而增加信號(hào)響應(yīng)特異性。對(duì)酶特異性底物進(jìn)行了篩選并對(duì)其使用濃度進(jìn)行了優(yōu)

9、化，最終確定為Amp4 mmol L-1。量熱檢測(cè)體系流速優(yōu)化為400μl min-1。新制備的ATZ-β濃度為0.8gL-1，優(yōu)化后最佳使用稀釋比為1∶100。ATZ-mAb與方法一中一致，濃度為2.8 mg mL-1，但是其最佳使用稀釋比優(yōu)化為1∶8000。再生液組分優(yōu)化為0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl溶液并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)及500 mmol L-1 NaCl。

10、　　本方法的建立實(shí)現(xiàn)了量熱檢測(cè)高靈敏度與強(qiáng)通用性的結(jié)合。離線孵育與流動(dòng)相分離更利于二者反應(yīng)條件的分別優(yōu)化。在優(yōu)化后的37℃、30min水浴并含有0.5％甘油的離線孵育環(huán)境中，ATZ與ATZ-β實(shí)現(xiàn)對(duì)mAb結(jié)合位點(diǎn)的充分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。以對(duì)mAb上Fc區(qū)域有特異識(shí)別能力的PGSFF柱為流動(dòng)相下識(shí)別元件，可以實(shí)現(xiàn)在不更換反應(yīng)柱的條件下對(duì)具有相應(yīng)抗體與酶標(biāo)待測(cè)物的任意待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)。PGSFF柱可重復(fù)使用次數(shù)不如固定化抗體柱的使用次數(shù)，但也足以滿(mǎn)足

11、實(shí)際檢測(cè)中對(duì)反應(yīng)柱連續(xù)檢測(cè)性能的需要。本方法成功實(shí)現(xiàn)對(duì)自來(lái)水加標(biāo)樣品的檢測(cè)。與方法一相比，在樣品前處理簡(jiǎn)便的前提下極大的提高了ATZ檢測(cè)靈敏度及可檢測(cè)目標(biāo)物范圍，為量熱傳感快速檢測(cè)技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論與技術(shù)支持。
　　3、基于雙功能表面分子印跡聚合物的量熱仿生傳感技術(shù)研究
　　針對(duì)傳統(tǒng)免疫檢測(cè)中作為識(shí)別元件的生物抗體制備周期長(zhǎng)、干擾因素多及檢測(cè)方法中用以促進(jìn)溶解的有機(jī)溶劑易對(duì)抗體活性造成損傷的不足，將模

12、擬抗體——微米級(jí)表面分子印跡聚合物(S-MIP)作為識(shí)別元件及產(chǎn)熱元件與量熱技術(shù)相結(jié)合建立量熱仿生傳感技術(shù)。
　　通過(guò)對(duì)比分析，本方法選定以SSS為功能單體，在氨基化CPG表面通過(guò)表面同步接枝印跡聚合技術(shù)制備S-MIP。印跡體系溶劑選用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相為pH3.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液。
　　與生物識(shí)別元件相比，本方法篩選并應(yīng)用的既可以作為識(shí)別元件也可以作為產(chǎn)熱元件的S-MIP，具備制備方法簡(jiǎn)便、制備周期

13、短，不同批次識(shí)別元件的一致性容易控制的優(yōu)勢(shì)。該方法的建立實(shí)現(xiàn)了農(nóng)藥殘留的無(wú)標(biāo)記、快速量熱檢測(cè)，通量較前兩種方法明顯高。本方法中反應(yīng)柱可重復(fù)使用百次以上而無(wú)需頻繁再生，非常利于大規(guī)模樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。但其特異性不足需要進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化印跡配方，制備新型印跡材料加以克服。
　　4、基于直接競(jìng)爭(zhēng)的農(nóng)藥殘留高靈敏量熱仿生傳感技術(shù)研究
　　在已有量熱仿生傳感技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化印跡配方及引入競(jìng)爭(zhēng)法建立高靈敏量熱仿生檢測(cè)方法。印跡體系

14、溶劑選用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相為pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液。印跡材料投料量為:模版分子ATZ2.85 g，功能單體MAA5.635 mL，交聯(lián)劑BIS1.46 g，引發(fā)劑APS0.136g;投料摩爾比為MAA∶ ATZ=5∶1，MAA∶ BIS=7∶1，APS為MAA質(zhì)量的1.1％。等溫吸附實(shí)驗(yàn)未觀測(cè)到明顯吸附。載液為0.02 mol L-1 pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，含有2％ DMF。體系溫度選定為37℃，流

15、速優(yōu)化為1000μL min-1。再生液為含有1mol L-1NaCl的50％(v/v)甲醇水溶液，再生時(shí)間為2min。與對(duì)苯乙烯磺酸鈉相比，以MAA為功能單體制備的印跡產(chǎn)物S-MIP可以產(chǎn)生明顯競(jìng)爭(zhēng)抑制信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立了高靈敏量熱仿生技術(shù)。0.8 mg mL-1 ATZ-β使用稀釋比優(yōu)化為1∶400，酶特異性底物Amp濃度為4 mmol L-1。該方法線性檢測(cè)范圍為0.6-4.1ng mL-1，檢出限為0.4 ng m

16、L-1。信號(hào)穩(wěn)定性良好，相同樣品連續(xù)上樣6次，信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在2％以?xún)?nèi)。該方法具有很好特異性，與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物西瑪津交叉反應(yīng)率僅為5.7％，與三聚氰胺交叉反應(yīng)率為3.7％。以自來(lái)水為目標(biāo)物進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在89.8％-95.3％之間，檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有較好的可比性。S-MIP可穩(wěn)定連續(xù)檢測(cè)30-50次。從進(jìn)樣到加入底物產(chǎn)生完整量熱響應(yīng)信號(hào)需約9 min。將進(jìn)樣前本底信號(hào)測(cè)量、進(jìn)樣并測(cè)定量

17、熱信號(hào)后的再生及流動(dòng)相恢復(fù)為載液后恢復(fù)穩(wěn)定基線的時(shí)間計(jì)算在內(nèi)，一個(gè)樣品的完整檢測(cè)時(shí)間為約30 min。雖然連續(xù)檢測(cè)樣品之間需要再生，但是在檢測(cè)靈敏度上較前一個(gè)建立的量熱仿生方法有3個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。S-MIP識(shí)別特異性?xún)?yōu)于ATZ的mAb，說(shuō)明合成的識(shí)別元件其識(shí)別能力可以?xún)?yōu)于單克隆抗體，為進(jìn)一步優(yōu)化印跡配方提供了理論支撐。在量熱信號(hào)上，隨著ATZ濃度增加，一定范圍內(nèi)信號(hào)響應(yīng)線性良好，實(shí)現(xiàn)了高靈敏量熱仿生技術(shù)的建立。
　　該方法實(shí)現(xiàn)了量