基于熒光分光光度法檢測(cè)土壤汞的研究.pdf

1、汞是一種對(duì)人體有毒害作用的重金屬，土壤中的汞能夠通過作物吸收并沿食物鏈傳遞至人體，在人體中具有累積效應(yīng)，攝入過多的汞會(huì)損害消化、神經(jīng)、泌尿及循環(huán)系統(tǒng)。汞已成為土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的必測(cè)項(xiàng)目之一，其定量檢測(cè)對(duì)于正確評(píng)價(jià)土壤汞的庫存量、及時(shí)開展土壤汞的污染修復(fù)具有十分重要的意義。熒光分光光度法檢測(cè)汞具有靈敏度高、檢出限低、選擇性好、簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，已應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等諸多領(lǐng)域，為快速而準(zhǔn)確地定量檢測(cè)樣品中的汞提供了一種非常有效的方

2、法。但是，如何進(jìn)一步拓展已有的熒光分析法在汞定量檢測(cè)中的應(yīng)用范圍，建立靈敏度更高、選擇性更好的土壤汞檢測(cè)方法，仍然是當(dāng)前需要解決的一項(xiàng)重要任務(wù)?；诖?，本文開展了以下四方面的研究。
　　1、利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)(MB)、單鏈核酸(ssDNA)及核酸染料Hoechst33258建立了一種土壤中汞的定量檢測(cè)方法。在該方法中，分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C-G堿基對(duì)，環(huán)設(shè)計(jì)為與ssDNA互補(bǔ)但有多個(gè)胸腺嘧啶（T堿基）錯(cuò)配的序列。沒有Hg2+時(shí)

3、，Hoechst33258與分子信標(biāo)作用較弱，其熒光信號(hào)很弱;有Hg2+時(shí)，分子信標(biāo)的環(huán)與富含T堿基的ssDNA通過“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(雙鏈DNA)，Hoechst33258與雙鏈DNA作用后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，Hg2+濃度在4×10-9-400×10-9 mol·L-1范圍內(nèi)，Hoechst33258的熒光強(qiáng)度(ΔI)與Hg2+濃度(C)之間具有良好的線性關(guān)系，方法檢出

4、限(3σ)為3×10-9 mol·L-1。應(yīng)用于污染土壤中汞的檢測(cè)，其平均回收率在98.3％-103.3％。該方法所用的分子信標(biāo)不需要標(biāo)記，檢測(cè)成本低，檢測(cè)速度快，但相對(duì)而言，靈敏度較低。
　　2、利用分子信標(biāo)、單鏈核酸(ssDNA)及高靈敏的核酸染料SYBR GreenⅠ，通過同步熒光分析法，建立了一種高靈敏度的土壤汞（Hg2+）定量檢測(cè)方法。分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)為熒光胺（6-carboxyfluorescein group，

5、FAM），環(huán)設(shè)計(jì)為與ssDNA互補(bǔ)且T堿基錯(cuò)配的序列。在Hg2+存在時(shí)，分子信標(biāo)的環(huán)與富含T堿基的ssDNA通過“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(雙鏈DNA)，分子信標(biāo)的莖被打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開，熒光恢復(fù);同時(shí)，核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA作用，熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)接近，當(dāng)Hg2+通過同步熒光分析法檢測(cè)時(shí)，兩種熒光染料的熒光峰重疊，熒光信號(hào)增強(qiáng)，可

6、實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，Hg2+濃度在5×10-10-400×10-10 mol·L-1時(shí)，SYBR GreenⅠ及FAM總的熒光強(qiáng)度(ΔI)與Hg2+濃度(C)間有良好的線性關(guān)系，方法檢測(cè)限(3σ)為3×10-10 mol·L-1。該法基于核酸染料SYBRGreenⅠ靈敏度高的特點(diǎn)，結(jié)合FAM標(biāo)記單鏈核酸，利用SYBR GreenⅠ及FAM總的熒光強(qiáng)度對(duì)土壤中的汞進(jìn)行檢測(cè)，可顯著地提高檢測(cè)靈敏度，降低其檢出限。

7、　　3、單色熒光定量檢測(cè)汞時(shí)，若樣品中存在能與探針反應(yīng)的核酸，容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)。為此，利用兩條部分互補(bǔ)、富含T堿基染料標(biāo)記的單鏈核酸，結(jié)合氧化石墨烯(GO)，采用同步熒光分析法，建立了一種土壤中汞的雙色定量檢測(cè)方法。這兩條單鏈核酸的3'端分別用6-carboxyfluorescein group(FAM)和6-carboxy-x-rhodamine(ROX)兩種染料標(biāo)記。沒有Hg2+存在時(shí)，染料標(biāo)記的單鏈核酸被吸附在GO的表面，熒光被

8、猝滅，信號(hào)很弱;有Hg2+存在時(shí)，兩條染料標(biāo)記的單鏈核酸與Hg2+通過“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，形成雙鏈核酸。由于雙鏈核酸不能被GO吸附，熒光不被猝滅，信號(hào)較強(qiáng)。在該體系中，F(xiàn)AM與ROX的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)間的間隔很近，在通過同步熒光進(jìn)行分析時(shí)，兩種染料的熒光信號(hào)可同時(shí)獲得，即可利用雙色熒光法對(duì)汞進(jìn)行定量檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，Hg2+濃度在8×10-10-8×10-8 mol·L-1的范圍內(nèi)，F(xiàn)AM與ROX總的熒光強(qiáng)度

9、與Hg2+的濃度之間具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為5×10-10 mol·L-1。這種方法可識(shí)別樣品中能與探針反應(yīng)的核酸所產(chǎn)生的假陽性信號(hào)，進(jìn)一步提高了土壤樣品中汞分析的選擇性。
　　4、在雙色熒光分析法檢測(cè)土壤汞的基礎(chǔ)上，利用兩條部分互補(bǔ)的富含T堿基的單鏈核酸（其中一條用染料ROX標(biāo)記），結(jié)合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，采用同步熒光分析法，建立一種靈敏度更高，檢測(cè)限更低的Hg2+雙色熒光定量檢測(cè)方法。沒有Hg2+時(shí)

10、，兩條單鏈核酸中有多個(gè)T-T錯(cuò)配堿基，不能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，核酸染料SYBR GreenⅠ與核酸的作用很弱，熒光信號(hào)不強(qiáng);加入氧化石墨烯時(shí)，兩種單鏈DNA均被氧化石墨烯吸附，熒光染料ROX的熒光被猝滅，熒光信號(hào)也很弱。有Hg2+時(shí)，兩條單鏈核酸通過“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，與SYBR GreenⅠ的作用增強(qiáng)，SYBR GreenⅠ的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng);加入氧化石墨烯時(shí)，雙鏈核酸不能被氧化石墨烯吸附，ROX的熒光不能被猝滅

11、，因此其熒光信號(hào)也會(huì)顯著增強(qiáng)。在優(yōu)化條件下，Hg2+濃度在5×10-10-500×10-10 mol·L-1之間時(shí)，SYBRGreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine(ROX)總的熒光強(qiáng)度（ΔIT）與Hg2+濃度(C)之間具有良好的線性關(guān)系，方法檢測(cè)限(3σ)為2×10-10 mol·L-1。該方法利用核酸染料SYBR GreenⅠ靈敏度高的特點(diǎn)，結(jié)合ROX標(biāo)記單鏈核酸，既可利用雙色信號(hào)識(shí)別樣品中的假陽性信號(hào)，又可顯著提高檢測(cè)

12、方法的靈敏度，降低方法的檢測(cè)限。
　　上述四種方法均成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤實(shí)際樣品的檢測(cè)。第一種檢測(cè)方法主要優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)成本低，適用于汞含量較高的土壤樣品的分析。第二種定量檢測(cè)方法最主要的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，檢出限低，適合土壤痕量汞的分析。第三種定量檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠識(shí)別樣品中能與探針反應(yīng)的核酸所產(chǎn)生的假陽性信號(hào)，顯著提高檢測(cè)的選擇性，適合檢測(cè)汞含量中等的土壤樣品。第四種定量檢測(cè)方法既能識(shí)別樣品中能與探針反應(yīng)的核酸所產(chǎn)生的假