DNA分子的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增、組裝及載藥研究.pdf

1、一直以來，DNA都是分子生物學(xué)、生物化學(xué)、藥物分析等學(xué)科研究領(lǐng)域的明星分子。人們?cè)噲D通過努力多方位地認(rèn)識(shí)DNA分子，以便更好地利用DNA分子來改造客觀世界。因此，精確地分析DNA并挖掘其潛在的生物學(xué)功能很有研究?jī)r(jià)值。本文試圖建立一種簡(jiǎn)單靈敏的短鏈DNA擴(kuò)增方法，并進(jìn)一步將DNA分子優(yōu)異的生物學(xué)性能用于材料組裝和靶向藥物運(yùn)載中。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)利用連接酶介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)建立短鏈DNA的分析方法。PCR

2、常用于臨床檢測(cè)病毒、細(xì)菌、細(xì)胞因子等的DNA或者RNA，但是通常只用于分析長(zhǎng)鏈DNA序列，不能用于短鏈DNA的直接檢測(cè)。我們通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了各自與靶物DNA一半互補(bǔ)的長(zhǎng)度均為52個(gè)堿基的長(zhǎng)鏈DNA作為檢測(cè)探針，在T4 DNA連接酶的作用下，這兩段探針能以短鏈靶物DNA為模板連成104個(gè)堿基的長(zhǎng)鏈，再將長(zhǎng)鏈用PCR擴(kuò)增，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)短鏈靶物DNA的間接放大檢測(cè)。借助DNA的特異性雜交作用以及PCR的擴(kuò)增作用，這段只有16個(gè)堿基的短鏈DNA的檢

3、測(cè)限低至100 fM，線性范圍跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)，而且這種方法的抗干擾能力強(qiáng)，即使在復(fù)雜生物介質(zhì)細(xì)胞裂解液中也能靈敏地分析靶物DNA。
　　(2)利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)生成的長(zhǎng)鏈DNA組裝金納米顆粒(AuNPs)。納米材料組裝體因其微米尺寸而呈現(xiàn)出一些優(yōu)于單體的光電性質(zhì)，成為了目前研究的熱點(diǎn)。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種新的DNA自組裝技術(shù)，它提供了一種合成長(zhǎng)鏈DNA的簡(jiǎn)單方法。基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的長(zhǎng)鏈DNA，本文建立了一種簡(jiǎn)單的納米材料

4、的組裝方法，只需通過金納米顆粒與巰基DNA之間形成共價(jià)鍵，就能實(shí)現(xiàn)金納米顆粒沿長(zhǎng)鏈DNA的組裝，其中長(zhǎng)鏈DNA是通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的。通過控制雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時(shí)間，可以得到長(zhǎng)短不一的DNA產(chǎn)物，再與金納米顆粒作用后，生成各種長(zhǎng)度的組裝體。研究發(fā)現(xiàn)，這種鏈狀的金納米顆粒組裝體能清晰地在暗場(chǎng)顯微鏡下成像，而單個(gè)金納米顆粒的散射信號(hào)非常微弱。這表明，組裝后材料的光散射性質(zhì)大大提高。
　　(3)金納米顆粒介導(dǎo)的DNA負(fù)載阿霉素(Dox)用

5、于癌癥的靶向治療。臨床癌癥治療中存在的主要問題有:藥物對(duì)正常組織的副作用大，藥物有效利用度低且耐受性差。因此建立有效的靶向給藥系統(tǒng)，克服以上不足，對(duì)癌癥的治療很有意義。葉酸是一種普遍研究的靶向配體，而對(duì)于一些不表達(dá)或者少量表達(dá)葉酸受體的癌細(xì)胞，尋找一些其他的靶向配體用于提高藥物的療效有必要。我們通過在金納米顆粒表面修飾上含有朊蛋白核酸適配子的DNA用于負(fù)載阿霉素，建立一種靶向治療母細(xì)胞瘤的給藥系統(tǒng)。借助于核酸適配子與神經(jīng)瘤母細(xì)胞的特異性

6、識(shí)別作用，導(dǎo)致DNA構(gòu)型發(fā)生改變，在癌癥部位釋放出阿霉素，特異性地殺死癌細(xì)胞。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)很好地驗(yàn)證了這種針對(duì)母細(xì)胞瘤的給藥系統(tǒng)的有效性。
　　綜上所述，本文首先建立了一種簡(jiǎn)單快速的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增短鏈DNA的方法，然后再利用DNA特殊的生物學(xué)性質(zhì)結(jié)合金納米顆粒優(yōu)良生物相容性及光電性質(zhì)，將它們應(yīng)用于納米材料組裝及靶向藥物運(yùn)載領(lǐng)域。本研究的優(yōu)勢(shì)在于:一是利用了PCR技術(shù)間接實(shí)現(xiàn)對(duì)短鏈DNA的靈敏分析;二是利用雜交鏈?zhǔn)桨l(fā)應(yīng)生