RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、RNA干擾，是最近發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于生命體中，高度保守的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。長度為21-25 nt的雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式，利用內(nèi)源性RNA干擾機(jī)制，高效、特異地降解靶標(biāo)RNA(mRNA)，從而消除該靶標(biāo)RNA的功能，例如其調(diào)控作用或其對(duì)應(yīng)蛋白的合成。人體內(nèi)源性RNA干擾途徑的發(fā)現(xiàn)，極大激發(fā)了核酸生物制藥技術(shù)的研究熱度。與傳統(tǒng)小分子藥物及抗體藥物相比，siRN

2、A借助廣譜的RNA干擾機(jī)制（更加廣譜的靶標(biāo)）和快速的一維藥物設(shè)計(jì)（針對(duì)靶標(biāo)堿基互補(bǔ)的一級(jí)序列），具有預(yù)防和治療眾多疾病的潛力，這些性質(zhì)毫無疑問使得RNAi藥物技術(shù)成為較為理想的生物制藥技術(shù)。
　　如此理想的藥物技術(shù)，在成藥性方面仍然面臨著挑戰(zhàn):siRNA血清穩(wěn)定性差，細(xì)胞膜通透性差，時(shí)有脫靶以及免疫副反應(yīng)。提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），將有利于降低給藥性難度以及副反應(yīng)。我們假設(shè):RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)將會(huì)影響RNA血清穩(wěn)定性以及

3、RNA干擾效率;同時(shí)，就像傳統(tǒng)的小分子制藥技術(shù)一樣，應(yīng)該可以利用外源性小分子增效RNA干擾過程。深入理解RNA結(jié)構(gòu)中影響RNA干擾效率的因素，毫無疑問，將加速RNA干擾技術(shù)的成藥進(jìn)程。本文圍繞如何提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），系統(tǒng)研究了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系。我們通過化學(xué)修飾siRNA，改變其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，提高了雙鏈siRNA引導(dǎo)鏈的干擾活性及鏈間選擇性，與此同時(shí)，通過化學(xué)修飾提高了RNA血清穩(wěn)定性;從而能進(jìn)一步

4、提高siRNA有效濃度。我們發(fā)現(xiàn)，確實(shí)可以找到小分子化合物增效RNA干擾過程，這一研究也促使我們?cè)诜肿铀缴侠斫馓囟ǖ鞍滓蜃釉赗NA干擾通路中的功能。
　　本文具體發(fā)現(xiàn)闡述如下:
　　一、高活性以及高特異性小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin-shaped RNA，shRNA）的設(shè)計(jì)合成與活性測試。
　　天然pre-microRNA或者病毒RNA中經(jīng)常出現(xiàn)的stem-loop結(jié)構(gòu)，促使我們思考:為什么這些RNA

5、總是含有確定的loop結(jié)構(gòu)，這些loop結(jié)構(gòu)的具體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)對(duì)于這些天然RNA功能的有效實(shí)現(xiàn)是否具有指導(dǎo)意義？含有l(wèi)oop結(jié)構(gòu)的shRNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具備有效的RNA干擾功能，但具體會(huì)體現(xiàn)到RNA干擾效率的哪幾個(gè)方面上？我們深入研究發(fā)現(xiàn):
　　1、與具有完全相同莖干區(qū)域的雙鏈siRNA相比，帶有3'-末端懸垂結(jié)構(gòu)的一類shRNA表現(xiàn)出3'-臂鏈RNA干擾活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)互補(bǔ)鏈RNA干擾活性極大降低，鏈選擇差異性可達(dá)到1000倍;這是首

6、次發(fā)現(xiàn)loop結(jié)構(gòu)的適當(dāng)存在，能夠極大改善RNA干擾中雙鏈的脫靶效應(yīng)。這也為經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的天然RNA的功能特異性提供了進(jìn)一步思考的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　2、改變shRNA5味'端和3'末端的特征結(jié)構(gòu)（包括平末端、5'懸垂結(jié)構(gòu)和3'懸垂結(jié)構(gòu)）以及l(fā)oop的大小，發(fā)現(xiàn)3'末端的懸垂結(jié)構(gòu)與loop結(jié)構(gòu)一道能夠增強(qiáng)3'-臂鏈的RNA干擾活性;這些結(jié)果表明RNA干擾效率所包含的高效性及選擇性，并不是單一因素就可以完全調(diào)控的。如何找到這些結(jié)構(gòu)因素的多因

7、子優(yōu)化配置將會(huì)極大影響RNA干擾效率，進(jìn)一步表明深入研究RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系是極為必要的。
　　3、通過改變莖干區(qū)域堿基序列以及l(fā)oop的大小和堿基組成，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于帶有3'-末端懸垂結(jié)構(gòu)的shRNA序列，其3'-臂鏈RNA干擾活性與shRNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性質(zhì)密切相關(guān)，即與loop的大小密切相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)因素的優(yōu)化使得我們首次得到了超高效RNA干擾效果(IC50達(dá)到8 pM)，我們也發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)優(yōu)化，可以同時(shí)降

8、低隨從鏈干擾活性，使得siRNA雙鏈各自的鏈選擇性達(dá)到1000倍，實(shí)現(xiàn)了siRNA成藥性的高活性和高靶標(biāo)特異性要求。這一類shRNA的超高效活性和超高效鏈選擇性的發(fā)現(xiàn)，暗示大家已經(jīng)接受的RNA干擾機(jī)制并不是完全清楚的過程。這些結(jié)果為我們進(jìn)一步深入理解RNA干擾過程提供了新的啟示。
　　本工作中所發(fā)現(xiàn)的純天然RNA修飾而建立的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與RNA干擾過程的構(gòu)效關(guān)系，促使我們思考，能否通過更加利于生物制藥的化學(xué)修飾，來同時(shí)實(shí)現(xiàn)siR

9、NA成藥性的高活性和高靶標(biāo)特異性（超高效鏈選擇性）。
　　二、高活性以及高穩(wěn)定性化學(xué)修飾siRNA的設(shè)計(jì)合成與性質(zhì)表征。
　　通過具有良好生物相容性的巰基-邁克爾加成反應(yīng)，我們使用小分子linker將末端巰基修飾的siRNA正義鏈和反義鏈進(jìn)行交聯(lián)，構(gòu)建不同類型的單端交聯(lián)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA和雙端交聯(lián)啞鈴結(jié)構(gòu)RNA。發(fā)現(xiàn):
　　1、單端交聯(lián)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA和雙端交聯(lián)的啞鈴型結(jié)構(gòu)RNA均表現(xiàn)出了比雙鏈對(duì)照序列顯著增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性

10、。雙端交聯(lián)的啞鈴型結(jié)構(gòu)RNA在50％正常人血清中的半衰期在48小時(shí)以上。這些工作表明，簡單的人工loop結(jié)構(gòu)就能夠提升RNA的血清穩(wěn)定性。
　　2、單、雙端交聯(lián)修飾的RNA序列能夠被RNA干擾途徑中的關(guān)鍵核酶Dicer選擇性識(shí)別并切割，釋放小干擾RNA，實(shí)現(xiàn)其RNA干擾效應(yīng)。表明簡單的人工loop結(jié)構(gòu)并不會(huì)極大干擾RNA干擾過程。當(dāng)然，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA干擾過程的精調(diào)，從而實(shí)現(xiàn)Dicer調(diào)控的RNA干擾過程的緩釋控制，仍然需要進(jìn)一步

11、的優(yōu)化工作。
　　3、我們將構(gòu)成交聯(lián)修飾序列的siRNA中反義鏈定義為A鏈，其互補(bǔ)鏈為B鏈。LhpRNA（B鏈5'接A鏈3'-loop結(jié)構(gòu)，具有B鏈3'懸垂結(jié)構(gòu)）顯示出B鏈RNA干擾活性顯著優(yōu)于RhpRNA序列（A鏈5'接B鏈3'-loop結(jié)構(gòu)，具有A鏈3'懸垂結(jié)構(gòu)）;相反的，RhpRNA中A鏈RNA干擾活性顯著優(yōu)于LhpRNA。同時(shí)，右端交聯(lián)序列RhpRNA表現(xiàn)出了極高的反義鏈RNA干擾活性，其對(duì)于靶標(biāo)mRNA沉默的IC50值6

12、 pM，為迄今所報(bào)道的最高效RNA干擾結(jié)果。
　　三、小分子依諾沙星增效RNA干擾過程的分子機(jī)制研究。
　　我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，小分子抗生素依諾沙星具有對(duì)于RNA干擾活性的增強(qiáng)效應(yīng)?？紤]到抗生素依諾沙星通過形成與DNA雙鏈復(fù)合物從而抑制DNA解旋酶(DNA gyrase)的殺菌機(jī)理，我們提出假設(shè):依諾沙星可能是通過與RNA解旋酶相互作用從而起到RNA干擾增效作用。文獻(xiàn)報(bào)道RHA（RNA解旋酶A）影響RISC復(fù)合物的上載，這些工作

13、促使我們聯(lián)想依諾沙星與RHA在RNA干擾途徑中的協(xié)同作用的可能性及其相互作用模式。通過在RHA正常表達(dá)、過量表達(dá)以及沉默的HEK293細(xì)胞中，對(duì)依諾沙星與RHA對(duì)于RNA干擾的調(diào)控現(xiàn)象的觀察，我們發(fā)現(xiàn):
　　1、依諾沙星對(duì)于siRNA雙鏈的任一鏈均具有RNA干擾增強(qiáng)作用;
　　2、在RHA特異性沉默的HEK293細(xì)胞中，依諾沙星的增強(qiáng)效應(yīng)降低或者消失。顯示依諾沙星對(duì)于RNA干擾活性的增強(qiáng)效應(yīng)具有RHA蛋白表達(dá)依賴性。

14、　　四、使用新型H2S熒光探針探索細(xì)胞內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程。
　　內(nèi)源性H2S生物學(xué)最近開始引起研究者關(guān)注，其具體機(jī)制仍然不甚清楚?？紤]到H2S的強(qiáng)生物還原性，我們認(rèn)為它不僅可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用，也可能在維持體內(nèi)氧化還原平衡中起到重要作用。文獻(xiàn)中認(rèn)為內(nèi)源性H2S的手性氨基酸起源仍然需要有效的機(jī)制驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)。我們發(fā)展了基于FRET效應(yīng)的比例型H2S熒光探針SR400，該熒光探針能滿足在活細(xì)胞中高靈敏度、高特異性、原

15、位實(shí)時(shí)定量地對(duì)于H2S進(jìn)行檢測。使用SR400探索HEK293細(xì)胞中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程。我們發(fā)現(xiàn):
　　1、D-半胱氨酸能夠比L-半胱氨酸更加有效地誘導(dǎo)內(nèi)源性H2S產(chǎn)生;
　　2、D/L-PPG分子能夠同時(shí)抑制D-半胱氨酸和L-半胱氨酸對(duì)于細(xì)胞內(nèi)源性H2S的誘導(dǎo)產(chǎn)生過程;
　　3、手性差異性抑制劑D-PPG對(duì)于D-半胱氨酸誘導(dǎo)過程的抑制強(qiáng)于對(duì)于L-半胱氨酸的誘導(dǎo)過程;相反，L-PPG對(duì)于L-半胱氨酸誘導(dǎo)過程的

16、抑制強(qiáng)于對(duì)于D-半胱氨酸的誘導(dǎo)過程。這種手性依賴的細(xì)胞內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生和抑制過程提示我們，D-半胱氨酸和L-半胱氨酸對(duì)于細(xì)胞內(nèi)源性H2S的誘導(dǎo)產(chǎn)生過程可能基于兩條完全相異的途徑。
　　這些工作將有助于通過利用我們發(fā)展的超高效及選擇性siRNA，對(duì)H2S產(chǎn)生和抑制（平衡）機(jī)制，進(jìn)行具體的酶促途徑的分類研究，從而理解內(nèi)源性H2S生物學(xué)奠定基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本博士論文圍繞如何提高RNA干擾效率（超高效性、選擇性），系統(tǒng)研究了

17、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA干擾效率的構(gòu)效關(guān)系。我們通過化學(xué)修飾siRNA，改變其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（loop結(jié)構(gòu)），顯著提高了雙鏈siRNA引導(dǎo)鏈的干擾活性及鏈間選擇性，以及RNA血清穩(wěn)定性。我們由此獲得迄今最高效的siRNA設(shè)計(jì)（IC50值＜10pM，鏈選擇性可達(dá)1000倍）。我們發(fā)現(xiàn)，依諾沙星以及RHA(RNA解旋酶A)分別對(duì)于siRNA雙鏈的任一鏈均具有RNA干擾增強(qiáng)作用。與此同時(shí)，依諾沙星對(duì)于RNA干擾活性的增強(qiáng)效應(yīng)具有RHA蛋白表達(dá)依賴性。