基于光化學(xué)表面改性制備高靈敏度聚合物基基因芯片的研究.pdf

1、近年來，聚合物越來越廣泛地被用作制備生物芯片的基底物質(zhì)。重要的是:這些材料能被用于多種領(lǐng)域。聚合物具有眾多優(yōu)勢(shì)比如低成本，堅(jiān)固結(jié)構(gòu)，易于構(gòu)造，快速成型。使用聚合物基質(zhì)一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是它們提供了各種各樣的表面性能，在某種情況下還能保留聚合物原有的性能。聚合物生物芯片制備技術(shù)是一種真正能代替普通玻璃基微陣列的技術(shù)。DNA微陣列體系通常是格式化的微型DNA探針，DNA芯片將有助于診斷和治療的結(jié)合以及引入個(gè)性化的藥物。生物分子的固定方法分為三類

2、，基于共價(jià)結(jié)合，物理吸附，或者綁定相互作用的親和力。共價(jià)結(jié)合常以氨基為基礎(chǔ)。大多數(shù)用于綁定的機(jī)理依靠于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，環(huán)氧基樹脂，醛類，或者碳二酰亞胺，這些都能與生物分子上的氨基共價(jià)結(jié)合。本課題探討了不同的共價(jià)結(jié)合方法用于在聚合物表面固定DNA，這對(duì)提高監(jiān)測(cè)靈敏性和用于特定生物分析的生物芯片的選擇性具有重要意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴COC有很多優(yōu)良的特性，包括高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，低自體熒光，光學(xué)透明性和耐有機(jī)

3、溶劑等。本研究中，我們使用一種新穎的方法將環(huán)氧基引入到COC表面，基于光催化氧化法(CPO)。首先，利用CPO方法將硫酸根陰離子引入到COC表面，然后硫酸根陰離子通過水解作用轉(zhuǎn)化成羥基，形成類玻璃表面，之后可以與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)。我們選用環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷將環(huán)氧基引入到COC薄膜表面，結(jié)果用XPS，水接觸角測(cè)量?jī)x和原子力顯微鏡表征。通過DNA末端的氨基與引入到COC表面的環(huán)氧基之間的共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)DNA探針在COC表面的固定。不同濃度的D

4、NA探針在COC表面的固定效率在45％～65％之間，與傳統(tǒng)的環(huán)氧化玻片相比相差無幾。得到的DNA微陣列與互補(bǔ)的靶基因?qū)崿F(xiàn)了成功雜交，雜交后熒光強(qiáng)度是由固定探針的密度或者雜交反應(yīng)液中靶基因的濃度決定。該方法在低成本的聚合物芯片的構(gòu)造中有相當(dāng)大的潛力。
　?、艵VA是一種被廣泛使用的乙烯共聚物，在EVA中極性的乙烯醋酸酯單元無規(guī)分散在結(jié)構(gòu)中，使得EVA具有良好的柔韌性，光透過性能，并粘附其他有機(jī)/無機(jī)材料。首先作為光引發(fā)劑的異丙基硫雜

5、蒽酮(ITX)在紫外光下引發(fā)共價(jià)結(jié)合到EVA表面形成異丙基硫雜蒽酮半頻哪醇(ITXSP)休眠基。固定在聚合物表面的ITXSP可作為一種反應(yīng)片段來引發(fā)乙烯基單體在可見光下的接枝。帶有環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)被用作在EVA表面引入環(huán)氧基的功能性單體。首先在EVA表層可見光輻照接枝一層PEGDA抗污染層，再在表面二次可見光接枝一層功能性的微陣列。用3D結(jié)構(gòu)制備DNA微陣列具有很重要的優(yōu)勢(shì):有更高的固定能力同時(shí)在固定分子之間有更長(zhǎng)

6、的間距。利用一系列的表征方法證明EVA表面成功引入環(huán)氧基同時(shí)獲得了更親水的表面特性。利用原子力顯微鏡可以觀察到二次可見光接枝GMA與PEGDA混合物的EVA表面有規(guī)整的帶有一定高度的三維環(huán)氧反應(yīng)柱，之后帶有氨基的DNA探針與反應(yīng)柱上的環(huán)氧基共價(jià)結(jié)合，利用掃描儀檢測(cè)到EVA表面成功固定上了DNA。這為之后的基因檢測(cè)以及更廣泛的生物應(yīng)用提供了有利因素。
　　⑶三維水凝膠微芯片的性能相對(duì)于二維平面微陣列芯片的優(yōu)點(diǎn)是固定能力高，固定分子周

7、圍有均勻的水環(huán)境，固定化分子與疏水的基質(zhì)表面沒有接觸，因此增加了芯片固定探針的穩(wěn)定性。本研究開發(fā)了一種新的共聚過程用于三維凝膠反應(yīng)柱的新型微芯片制備。使用氨基化的DNA，單體選用丙烯酰胺，氨基化的DNA能結(jié)合到增長(zhǎng)的聚丙烯酰胺鏈上，首先將氨基化的DNA與形成凝膠的丙烯酰胺單體混合，之后用點(diǎn)樣儀將聚合反應(yīng)的混合物的液滴噴點(diǎn)到LDPE表面進(jìn)行UV輻照引發(fā)DNA與丙烯酰胺之間的共聚合反應(yīng)。結(jié)果顯示DNA固定前后的固定效率大于80％，說明利用該

8、方法DNA成功地引入到了LDPE表面。LDPE表面固定的凝膠柱的力學(xué)和熱學(xué)性能都很穩(wěn)定。這為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。
　?、饶壳芭R床上檢測(cè)膠質(zhì)瘤病變級(jí)數(shù)的方法比較復(fù)雜而且不準(zhǔn)確。利用上述方法制備的LDPE凝膠固定DNA微芯片檢測(cè)膠質(zhì)瘤病變級(jí)數(shù)。25條特異性的膠質(zhì)瘤分級(jí)相關(guān)基因作為探針與從膠質(zhì)瘤組織中提取的DNA探針進(jìn)行雜交，觀察雜交情況確定病變級(jí)數(shù)。本研究使用一級(jí)和四級(jí)病變級(jí)數(shù)的膠質(zhì)瘤組織，先從組織中提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cD