基于電場驅(qū)動的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　免疫層析檢測技術(shù)是一種經(jīng)典的即時(shí)檢測（point-of-care testing，POCT）技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品安全檢驗(yàn)、生物反恐偵檢等多個(gè)領(lǐng)域。近年來，隨著現(xiàn)代科學(xué)的不斷進(jìn)步，生物醫(yī)藥與納米材料、光電子等不同學(xué)科的交叉融合產(chǎn)生和發(fā)展了一系列高新生物技術(shù)，同時(shí)也為免疫層析技術(shù)的深入發(fā)展提供了新的契機(jī)與動力。本研究將外部電場引入到上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測技術(shù)體系中，擬以電場作為層析驅(qū)動力來進(jìn)一步提升免疫層析的

2、檢測速度和檢測性能，從而建立一種新型的電場驅(qū)動式免疫層析快速檢測技術(shù)，即電致免疫層析技術(shù)，簡稱電致層析。
　　方法：
　　[1]電致層析理論體系與技術(shù)平臺的建立：首先，構(gòu)建免疫層析有關(guān)層析運(yùn)動的物理模型，從理論上闡釋外加電場對層析動力的影響及作用規(guī)律，從而建立電致層析檢測技術(shù)的層析動力學(xué)理論體系。其次，基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)平臺進(jìn)行電致層析實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺的搭建，并通過實(shí)驗(yàn)來觀測外加電場對免疫層析試紙檢測信號的影響，進(jìn)行電致層

3、析理論模型的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　[2]電致層析動力學(xué)研究及生物效應(yīng)評價(jià)：以鼠疫耶爾森氏菌（簡稱鼠疫菌）檢測試紙為實(shí)驗(yàn)對象，鼠疫菌為檢測靶標(biāo)，實(shí)時(shí)觀測不同電場方向和電場強(qiáng)度對試紙檢測信號以及檢測速度的影響，從而闡釋外加電場對層析動力的作用規(guī)律；同時(shí)，詳細(xì)研究不同強(qiáng)度外加電場對鼠疫菌檢測敏感性的影響，并對其可能影響機(jī)制進(jìn)行探討，依此進(jìn)行電致層析檢測敏感性的優(yōu)化研究。
　　[3]電致層析技術(shù)在病原菌快速檢測中的應(yīng)用：以鼠疫菌為檢測靶標(biāo)

4、，以上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析方法（無電場）為對照，系統(tǒng)評價(jià)電致層析在鼠疫菌快速檢測中的綜合性能，包括檢測敏感性、定量線性和精密性；采用假結(jié)核耶爾森氏菌、小腸耶爾森氏菌以及炭疽芽孢桿菌等種屬近緣或特定情況下可能同時(shí)存在的菌株進(jìn)行電致層析檢測特異性評價(jià)；在鼠疫菌液中加入一定濃度的酸、堿、鹽、粘性物質(zhì)以及生物基質(zhì)（生物大分子）等不同類型的干擾物，評價(jià)電致層析對復(fù)雜樣品的檢測耐受性。
　　結(jié)果：
　　[1]電致層析理論體系與技術(shù)平臺的建立：

5、以試紙中信號源顆粒濃度為模型參數(shù)，基于相場模型構(gòu)建了電致層析的理論模型；以方程的形式從理論上分析了外加電場對層析動力的影響，解析了電場在顆粒濃度分布、流量分布和流速分布中的動力作用。另外，我們基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)平臺搭建了電致層析技術(shù)平臺，實(shí)現(xiàn)了對電場作用下的試紙檢測信號的實(shí)時(shí)監(jiān)測；結(jié)果顯示，試紙檢測信號的強(qiáng)度增長率隨著正向（電場方向與層析流動方向一致為正向，反之為反向）電場強(qiáng)度的增加而增加，并且實(shí)驗(yàn)測試值與基于理論模型的預(yù)測值具有

6、較高的一致性。
　　[2]電致層析動力學(xué)研究及生物效應(yīng)評價(jià)：在試紙上施加不同方向的電場并對檢測信號進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)正向電場在15V強(qiáng)度下即可顯著提高試紙的檢測信號強(qiáng)度，而反向電場則對檢測信號具有明顯的抑制作用。進(jìn)一步分析不同強(qiáng)度（15~60V）正向電場作用下的試紙檢測信號強(qiáng)度及層析速度：（1）隨著電場強(qiáng)度的增加，試紙檢測信號強(qiáng)度也逐漸增加，但是到60V時(shí)信號開始回落；（2）層析速度（信號平臺）隨著電場強(qiáng)度的增加而逐漸加快，檢測信號進(jìn)

7、入平臺期的時(shí)間可由15min縮短至5min。結(jié)果表明外加電場可以有效地促進(jìn)作為信號源的上轉(zhuǎn)發(fā)光納米顆粒從試紙結(jié)合墊中的解離，并且加快顆粒的層析速度。電致層析生物效應(yīng)評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施加電場（20~50V）可使免疫層析反應(yīng)時(shí)間縮短至5min，且檢測敏感性隨著電場強(qiáng)度增加而增加。
　　[3]電致層析技術(shù)在病原菌快速檢測中的應(yīng)用：電致上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析可將檢測時(shí)間縮短至5min，且檢測敏感性、定量范圍、精密性、特異性、樣品耐受性等綜合性

8、能并未因此受到影響。就鼠疫菌檢測而言，最低檢測限可達(dá)5.0×102CFU/mL，與上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析（未加電）檢測法敏感性相當(dāng)；可對5.0×102CFU/mL~5.0×106CFU/mL濃度范圍內(nèi)的鼠疫菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量（R2=0.9978），并且檢測結(jié)果具有較高的精密性（CV≤10％）；與假結(jié)核耶爾森氏菌、小腸耶爾森氏菌以及炭疽芽孢桿菌等九種種屬近緣菌株或或特定情況下可能同時(shí)存在的菌株均未見交叉反應(yīng)；在較高濃度的HCl（pH≥3）、NaOH

9、（pH≤12）、NaCl（≤0.5M）、PEG20000（≤5%）、BSA（≤200mg/mL）等干擾物質(zhì)存在于檢測樣品中時(shí)，電致層析檢測體系均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，鼠疫菌最低檢測限仍可達(dá)到5.0×102CFU/mL~5.0×103CFU/mL。
　　結(jié)論：
　　本研究基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)平臺，建立了一種電場驅(qū)動的新型免疫層析快速檢測技術(shù)，即電致層析。我們首先構(gòu)建了電致層析的物理模型，從理論上分析了外加電場在層析動力中的作

10、用，并對理論模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。基于鼠疫菌檢測試紙，我們從實(shí)驗(yàn)方面詳細(xì)分析了不同電場條件對層析動力的影響及作用規(guī)律：電致層析可以有效促進(jìn)信號源顆粒從試紙結(jié)合墊的解離，并提高顆粒的層析速率，從而可以明顯加快層析反應(yīng)的進(jìn)程，縮短檢測所需時(shí)間。以鼠疫菌為檢測靶標(biāo)，結(jié)果顯示，電致層析在將上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測用時(shí)由15min顯著縮短至5min的同時(shí)，仍然可以保持優(yōu)越的檢測敏感性、特異性以及定量準(zhǔn)確性等性能；并且，電致層析同樣展現(xiàn)出較強(qiáng)的樣本耐受性