綠肥輪作水稻種子內(nèi)生菌多樣性及土壤微生物數(shù)量研究.pdf

1、本研究以湖南祁陽農(nóng)田系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站具有30年(1982-2012)長(zhǎng)期定位歷史的稻-稻-紫云英及稻-稻-冬閑輪作水稻種子、根際及稻田土壤為材料，采用先進(jìn)的分子生態(tài)學(xué)方法與傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法相結(jié)合，深入系統(tǒng)地研究綠肥輪作對(duì)水稻微生物多樣性及數(shù)量的影響。本試驗(yàn)同時(shí)對(duì)分離培養(yǎng)的水稻種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分泌生長(zhǎng)素（IAA）功能的定性、定量研究。
　　 采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法和先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)RMV與RWF可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研

2、究，從而了解其內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性。對(duì)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:稻-稻-紫云英(RMV)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量明顯大于稻-稻-冬閑(RWF）。利用純培養(yǎng)方法共獲得108株內(nèi)生細(xì)菌，其中對(duì)照樣品RWF42株，試驗(yàn)樣品RMV66株。16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，RWF的42株內(nèi)生細(xì)菌分屬于9屬13個(gè)種;RMV的66株分屬于15屬26個(gè)種，其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)只存在于RMV處理樣品中。同時(shí)以34株不同種屬

3、內(nèi)生細(xì)菌為代表，定性、定量地測(cè)定其分泌IAA能力，其中RMV10、RMV17、RMV14和RMV20細(xì)菌分泌量最高，分屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、微桿菌屬(Microbacterium)及甲基桿菌屬(Methylobacterium)。
　　 利用細(xì)菌通用引物，對(duì)2個(gè)水稻種子樣品提取的總DNA進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，構(gòu)建克隆文庫，分析內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果顯示，

4、γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)在2個(gè)樣品中均占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。其中與黃單胞菌屬（Xanthomonas)、中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)及檸檬酸桿菌屬（Citrobacer相似性較高的3個(gè)克隆序列均在樣品RMV中，而RWF中未發(fā)現(xiàn)。利用Mothur軟件評(píng)價(jià)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫多樣性，結(jié)果為RMV內(nèi)生細(xì)菌克隆文庫多樣性指數(shù)均較RWF高，證明綠肥還田模式種植的水稻種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性較為豐富。
　　 通過

5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)方法分別對(duì)稻-稻-紫云英、稻-稻-冬閑的土壤(SMV、SWF)和根(RSMV、RSWF)中的細(xì)菌、古菌、氨氧化細(xì)菌(AOB)及氨氧化古菌（AOA)的數(shù)量進(jìn)行探討。結(jié)果表明，RSMV中細(xì)菌、古菌及AOB和AOA的數(shù)量均較RSWF高;而在稻田土壤中，SMV中的細(xì)菌和AOB數(shù)量比對(duì)照高，但古菌和AOA數(shù)量低于SWF，表明綠肥輪作對(duì)微