長(zhǎng)期豆科綠肥輪作水稻根內(nèi)生細(xì)菌多樣性及促生功能研究.pdf

1、大量研究證實(shí)，綠肥是保持和提高土壤肥力和質(zhì)量的有效措施之一，雖然已有綠肥對(duì)土壤微生物影響的相關(guān)研究報(bào)道，但由于所用方法和技術(shù)所限，相關(guān)研究既不系統(tǒng)也不深入，特別是綠肥對(duì)水稻根內(nèi)生細(xì)菌影響研究尚屬空白。 本課題以湖南祁陽(yáng)農(nóng)田系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站具有28年(1982-2010)長(zhǎng)期定位歷史的稻一稻一紫云英豆科綠肥及稻-稻-冬閑輪作水稻根為材料，采用基于16S rDNA為基礎(chǔ)的先進(jìn)分子生態(tài)學(xué)方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合，深入系統(tǒng)研究紫云英綠

2、肥輪作水稻根內(nèi)生微生物多樣性。
　　 本研究同時(shí)將針對(duì)性地分離培養(yǎng)微生物類群，對(duì)可培養(yǎng)微生物溶磷性，產(chǎn)植物生長(zhǎng)素(IAA)，產(chǎn)鐵載體，拮抗及固氮酶活性等促生功能研究。
　　 通過(guò)培養(yǎng)方法檢測(cè)水稻根內(nèi)生微生物數(shù)量，結(jié)果表明：稻-稻-紫云英綠肥輪作系統(tǒng)水稻根中微生物平均數(shù)量為7.75×106cfu·g-1鮮土，比稻-稻-冬閑高78.17％。通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法從稻-稻-冬閑和稻-稻-紫云英水稻根中分別分離77株和169株

3、細(xì)菌。對(duì)246株細(xì)菌溶磷、分泌生長(zhǎng)素(IAA)及分泌鐵載體的功能進(jìn)行了初步測(cè)定，結(jié)果表明稻-稻-紫云英內(nèi)生細(xì)菌具有溶解無(wú)機(jī)磷活性、溶解有機(jī)磷活性、分泌生長(zhǎng)素(IAA)能力及產(chǎn)鐵載體能力菌株分別為139、12、72、73株，稻-稻-冬閑分別為67、8、40、57株。其中菌株ZYY43的溶磷活性最高；菌株ZYY170產(chǎn)IAA能力最高，為419.17ug/mL；菌株DX78分泌鐵載體能力最強(qiáng)，達(dá)到了“++++”的水平。
　　 在上述研

4、究基礎(chǔ)上選取48株菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3株菌對(duì)棉花紅腐病菌(Fusarium moniliforme ACCC36127)有抑制作用，其中的2株對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonascampestris pv.oryzae ACCC05509)有抑制作用。固氮酶活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株DX35的固氮酶活性最高為181.21nmolC2H4/mg protein hr，為參比菌株圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcu

5、m ACCC10006)的10倍左右，在固氮菌肥開(kāi)發(fā)方面具有非常大的應(yīng)用潛力。并在此基礎(chǔ)上利用大試管和盆栽水稻促生試驗(yàn)的方法篩選10株兼具多種促生功能的優(yōu)良菌株，菌株ZYY5、ZYY10和ZYY136準(zhǔn)備進(jìn)行田間試驗(yàn)。
　　 采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)稻-稻-紫云英和稻-稻-冬閑水稻根內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究。用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和RsaⅠ聯(lián)合酶切，獲得246株菌酶切指紋圖譜。結(jié)果表明，HaeⅢ和Rsa

6、Ⅰ聯(lián)合酶切產(chǎn)生了23個(gè)基因分型，單一酶切產(chǎn)生的基因分型少。16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，分離得到的77株稻，稻冬閑細(xì)菌分屬14屬15個(gè)種，分離得到的169株稻，稻紫云英細(xì)菌分屬19屬21個(gè)種。兩個(gè)樣品中細(xì)菌群落大多數(shù)為變形菌綱(Proteobacteria)。其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，其次為γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)，其他分屬α-變形菌綱(α-proteobacter

7、ia)及厚壁菌門(Firmicutes)。放線菌門(Actinobacteria)只存在于稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌中。其中Herbaspirillum和Cedecea為兩個(gè)處理中分離到的共有優(yōu)勢(shì)種群，而稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)生細(xì)菌中的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)，假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和泛菌屬(Pantoea)也為分離到的優(yōu)勢(shì)種群，且在稻-稻-紫云英水稻根

8、這一特殊的生存空間中有1株潛在的根瘤菌屬(Rhizobium)新種存在。
　　 可培養(yǎng)的細(xì)菌中，編號(hào)為ZYY136菌株其16S rDNA基因序列在NCBI Blast中比對(duì)發(fā)現(xiàn)與根瘤菌屬(Rhizobium)的Rhizobium alkalisoli(CCBAU01393)的同源性最高，為96.174%。以近緣菌株CCBAU01393(Rhizobium alkalisoli)和SO2(Rhizobium huautlense)

9、為參比菌株，采用多相分類方法，對(duì)其形態(tài)學(xué)特征、唯一碳氮源利用、脂肪酸組成成分分析(MIDI)、ERIC-PCR和BOX-PCR指紋圖譜分析、16S rDNA全序列分析及atpD、gltA、gyrB、recA、rpoB、thrC持家基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，ZYY136菌株為根瘤菌屬(Rhizobium)的一個(gè)新種。
　　 利用細(xì)菌通用引物，對(duì)從2個(gè)水稻根樣品中提取總DNA進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，

10、構(gòu)建克隆文庫(kù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，2個(gè)水稻根樣品中細(xì)菌群落大多數(shù)為變形菌綱(Proteobacteria)。其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，其次為α-變形菌綱(α-proteobacteria)和δ-變形菌綱(δ-proteobacteria)，其他分屬及厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Acidobacteria)等，但在所占比例上有較大區(qū)別

11、。且(Armatimonadetes)在稻-稻-冬閑模式(DX)水稻根中存在，而稻-稻-紫云英豆科綠肥還田(ZYY)處理中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。其中伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)和根瘤菌(Bradyrhizobium)為兩個(gè)處理中分離到的共有優(yōu)勢(shì)種群，而其數(shù)量在稻-稻-紫云英水稻根內(nèi)分布較高。
　　 純培養(yǎng)方法從稻-稻-冬閑和稻-稻-紫云英水稻根樣品中得到的細(xì)菌群落與克隆文庫(kù)構(gòu)建檢測(cè)到的群落多樣性相比，均發(fā)現(xiàn)2個(gè)水稻根樣品中細(xì)