天然內(nèi)生菌群人工接種香蕉組培苗及對(duì)香蕉枯萎病的防治.pdf

1、由半知菌亞門鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp．cubense Snyder & Hansen)引起的香蕉枯萎病，是一種典型的維管束病害和重要的土傳病害，同時(shí)也是目前世界范圍內(nèi)香蕉生產(chǎn)上的毀滅性病害，其中尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種(Fusarium oxysporum f. sp．cubense race4)的致病力最強(qiáng)。本研究試圖利用未經(jīng)培養(yǎng)的天然內(nèi)生菌群的群體生物學(xué)活性，來(lái)提高香蕉組

2、培苗對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種引起的香蕉枯萎病的抗病能力。 通過(guò)人工接種的方法，成功將健康成年香蕉植株根部?jī)?nèi)生菌群直接接種至香蕉組培苗體內(nèi)，定殖于人工接種組培苗根部的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為5.3×105CFU/gFW，定殖于假莖部的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為4.9×104 CFU/g FW，假莖部的內(nèi)生細(xì)菌類群與根部?jī)?nèi)生細(xì)菌類群相似性很高，但多樣性指數(shù)低于根部。對(duì)人工接種組培苗內(nèi)生細(xì)菌的類群多樣性分析，采用了液氮研磨法和緩沖液振蕩法提取組織

3、總DNA，并用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)評(píng)估了兩種提取方法對(duì)多樣性分析的差異，結(jié)果表明緩沖液振蕩法提取的DNA表現(xiàn)出較好的內(nèi)生細(xì)菌基因組多樣性。為了減少葉綠體16S rRNA基因在不依賴于培養(yǎng)方法分析內(nèi)生細(xì)菌多樣性中的干擾，設(shè)計(jì)了一條真細(xì)菌特異的16SrRNA通用反向引物R1520，用梯度PCR和DGGE方法評(píng)估了這條引物在PCR反應(yīng)中對(duì)葉綠體16S

4、rRNA的擴(kuò)增效率，發(fā)現(xiàn)與常用的16S rRNA通用反向引物R1942相比，葉綠體16S rRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯減少，且真細(xì)菌的檢出率沒(méi)有受到影響。通過(guò)改良引物法降低葉綠體干擾對(duì)分析植物環(huán)境樣品中微生物多樣性是可行的。應(yīng)用依賴于培養(yǎng)的DGGE方法和不依賴于培養(yǎng)的DGGE方法對(duì)人工接種組培苗內(nèi)生細(xì)菌的類群組成進(jìn)行了分析，后者得到的分型條帶比前者得到的分型條帶數(shù)量多且多樣性指數(shù)更高，將熒光強(qiáng)度較大的條帶回收測(cè)序，結(jié)果表明兩種分析方法得到的

5、人工接種組培苗的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌類群均為Gamma-proteobacteria(γ-Proteobacteria)，但是依賴于培養(yǎng)的方法沒(méi)有檢測(cè)到一些苛養(yǎng)型內(nèi)生細(xì)菌和未培養(yǎng)(uncultured)內(nèi)生細(xì)菌；不依賴于培養(yǎng)的方法更適用于研究類群多樣性。用構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)的方法對(duì)人工接種組培苗根部環(huán)境的內(nèi)生細(xì)菌作進(jìn)一步詳細(xì)的分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌類群豐富，測(cè)序克隆子歸屬于13個(gè)屬，其中γ-Proteobacteria類群的出現(xiàn)頻率最高，

6、達(dá)到46.94％，是人工接種組培苗根部環(huán)境內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群，其次為依賴于培養(yǎng)的方法沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的Beta-proteobacteria(β-Proteobacteria)類群，出現(xiàn)頻率為32.65％，而屬于γ-Proteobacteria類群的假單胞菌屬(Pseudomonas sp．)的出現(xiàn)頻率為24.49％，為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，屬于β-Proteobacteria類群的草螺菌屬(Herbaspirillum sp．)和伯克霍爾德菌屬(B

7、urkholderia sp．)的出現(xiàn)頻率分別為14.29％和12.25％。 溫室條件下，用抗性基因標(biāo)記過(guò)的枯萎病菌感染香蕉組培苗，其致病力與野生型枯萎病菌沒(méi)有差異。DGGE分析結(jié)果表明，病原菌侵染的人工接種組培苗內(nèi)生細(xì)菌的類群數(shù)量和多樣性指數(shù)均有所增加，根部環(huán)境中歸屬于芽胞桿菌屬(Bacillus megaterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas aureofaciens)細(xì)菌類型，以及假莖部環(huán)境中歸屬于假單胞菌屬(

8、Pseudomonas sp．HR 13)細(xì)菌類型的數(shù)量急劇增加。分析人工接種組培苗對(duì)香蕉枯萎病防治效果，接種病原菌5個(gè)月后，內(nèi)生菌群人工接種的組培苗的相對(duì)病指防效達(dá)到66.93％，且在感病1個(gè)月時(shí)，通過(guò)半定量PCR分析病原菌標(biāo)記基因的數(shù)量，人工接種組培苗體內(nèi)的病原菌標(biāo)記基因數(shù)量比未接種內(nèi)生菌群的香蕉組培苗降低了54％，表示人工接種組培苗體內(nèi)枯萎病菌的繁殖因內(nèi)生菌群的生物學(xué)活性而受到了抑制。 對(duì)人工接種組培苗內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)活性

9、進(jìn)行分析，平板對(duì)峙法篩選對(duì)枯萎病菌具有拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌，挑選2株初步鑒定為芽胞桿菌屬和1株假單胞菌屬的內(nèi)生拮抗細(xì)菌，其菌體在PDA平板上對(duì)枯萎病菌的抑制率為76％～80％，溫室條件下回接香蕉組培苗后對(duì)枯萎病的相對(duì)病指防效為65％～70％，且假單胞菌株對(duì)香蕉組培苗的促生作用很明顯。對(duì)這3株內(nèi)生拮抗細(xì)菌可能的生防因子進(jìn)行篩選，芽胞桿菌屬的2株內(nèi)生細(xì)菌分別可以分泌鐵載體和產(chǎn)生較弱的蛋白酶，假單胞菌屬的內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生氰化氫及抗生素2,4-二

10、乙酰間苯三酚(2,4-DAPG/PHL)和吩嗪羧酸(PCA)。內(nèi)生菌群對(duì)枯萎病菌除了具有直接抑制作用，人工接種至香蕉組培苗后，還會(huì)誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生抗病相關(guān)的防御酶對(duì)抗枯萎病菌的侵染，測(cè)定香蕉組培苗在枯萎病菌接種后2周內(nèi)防御酶PPO，POD，PAL和SOD活性變化發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌群接種的香蕉組培苗PPO，POD和SOD酶活都有所升高，表示香蕉組培苗受到內(nèi)生菌群的誘導(dǎo)增強(qiáng)了對(duì)抗枯萎病菌入侵的能力。利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了一株分離頻率較高的腸桿菌屬

11、(Enterobacter sp．)內(nèi)生細(xì)菌KL2的rpoS基因突變株，通過(guò)分析野生株和突變株對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性及在香蕉組培苗根部?jī)?nèi)的定殖數(shù)量發(fā)現(xiàn)，rpoS基因的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)內(nèi)生細(xì)菌KL2對(duì)乙醇、高滲、過(guò)氧化物、穩(wěn)定期和營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境脅迫的抗逆性，缺失了該基因的突變株在植物宿主體內(nèi)的定殖能力會(huì)受到影響。 綜述所述，本論文的研究證實(shí)了未經(jīng)培養(yǎng)的天然內(nèi)生菌群人工接種組培苗能夠有效地防治香蕉枯萎病，而且這種生防能力和內(nèi)生菌群的生物學(xué)活性關(guān)系