高選擇性高靈敏度糖肽富集及質(zhì)譜檢測(cè)新技術(shù)與新方法.pdf

1、本論文針對(duì)糖蛋白質(zhì)組和糖肽組研究中糖基化多肽質(zhì)譜檢測(cè)所面臨的糖肽含量少、非糖肽干擾大、檢測(cè)靈敏度低等熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，發(fā)展了硼酸功能化介孔納米材料(MCM-41-GLYMO-APB，MCM-41-APTES-CPB)和肼功能化聚合物磁性納米復(fù)合材料(Fe3O4@PMAH)，實(shí)現(xiàn)了糖基化多肽的高選擇性分離富集和高靈敏度質(zhì)譜檢測(cè)，并成功用于高特異性揭示復(fù)雜生物樣品大鼠血清和蝰蛇蛇毒中的糖肽組以及腸癌病人血清中糖蛋白質(zhì)的鑒定。
　　糖基化作

2、為蛋白質(zhì)最常見、最重要和最復(fù)雜的翻譯后修飾之一，具有極其重要的生物學(xué)意義。糖基化修飾可影響蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)或決定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)送方向等，在細(xì)胞與基質(zhì)間的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育與分化過程中都起著重要作用。研究表明，糖鏈的變化與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的超過一半的癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物都是糖基化蛋白質(zhì)和糖基化多肽。因此，糖蛋白和糖肽的研究對(duì)于臨床疾病的早期診斷以及生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等具有極其重要的意義。然而，盡管哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中超過

3、50％發(fā)生了糖基化，但是糖基化肽段卻僅占到蛋白質(zhì)酶解肽段的2～5％;并且糖鏈的微觀不均一性進(jìn)一步減少了糖肽的相對(duì)量和降低了檢測(cè)的靈敏度;在質(zhì)譜分析的過程中，糖肽的質(zhì)譜信號(hào)很容易受到非糖肽的抑制，因此糖基化的研究充滿挑戰(zhàn)。如何將糖肽從復(fù)雜體系中高選擇性地分離出來并達(dá)到質(zhì)譜可以檢測(cè)的水平，是糖蛋白質(zhì)組研究首先要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。
　　多肽組，即蛋白質(zhì)組中低分子量的部分，自2001年首次被提出后，在最近十來年中已經(jīng)引起了大家持續(xù)的關(guān)注

4、。一般認(rèn)為血清樣品中含有一些低分子量循環(huán)蛋白和肽段，而這些小分子量部分則是獲取信息的豐富資源。通過質(zhì)譜分析生物樣品中的多肽組可以潛在地提供癌癥和其他疾病的診斷和早診信息。蛇毒是從蛇毒腺中分泌的許多具有藥理學(xué)活性的功能性酶及多肽的復(fù)雜混合物。它可以麻痹和殺死獵物，也是開發(fā)新型藥物的寶貴資源。研究毒液多肽非常重要，有利于挖掘具有治療應(yīng)用潛力的生物活性分子。盡管目前關(guān)于多肽組重要性的認(rèn)識(shí)已經(jīng)日趨增加，然而極少有關(guān)于翻譯后修飾多肽組的報(bào)道，主要

5、是如下一些困難阻礙了糖肽組的研究。首先，復(fù)雜生物樣品中的蛋白組具有極高的動(dòng)態(tài)范圍，使得糖肽組的分析非常具有挑戰(zhàn)性。其次，與多肽組相似，糖肽組的分子量大多小于20 kDa，而這正是傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)難以覆蓋到的區(qū)域。最后，與非糖基化肽段相比，糖基化肽段常常以相對(duì)低的豐度存在（2％-5％），并且糖鏈的微觀不均一性進(jìn)一步減少了糖基化肽段的相對(duì)量和降低了檢測(cè)的靈敏度。因此，迫切需要發(fā)展一種能克服傳統(tǒng)研究方法局限性能用于糖肽組研究的特定方法。

6、r>　　針對(duì)以上糖蛋白質(zhì)組和糖肽組研究中糖基化多肽的分離富集和質(zhì)譜檢測(cè)的問題，本博士學(xué)位論文分為五個(gè)章節(jié)開展研究工作。各章節(jié)主要內(nèi)容如下:
　　第一章緒論部分。本章主要論述了基于生物質(zhì)譜的多肽組學(xué)研究進(jìn)展，糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)策略概述，以及納米材料在糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。詳細(xì)論述了多肽提取樣品前處理方法的發(fā)展現(xiàn)狀及遇到的挑戰(zhàn)，當(dāng)前糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究分離與富集技術(shù)策略的比較及總結(jié)，適用于糖蛋白質(zhì)組學(xué)富集研究目的各種納米材料

7、的發(fā)展現(xiàn)狀。從而引出本論文工作的研究方向，為設(shè)計(jì)發(fā)展高選擇性高靈敏度糖肽富集和質(zhì)譜檢測(cè)新技術(shù)與新方法提出理論依據(jù)和實(shí)際意義。
　　第二章針對(duì)糖蛋白質(zhì)組研究中如何將糖肽從復(fù)雜體系中高選擇性地分離出來并達(dá)到質(zhì)譜可以檢測(cè)的水平這個(gè)關(guān)鍵問題，以及糖肽組研究中關(guān)于內(nèi)源性糖肽提取尚無合適樣品前處理方法的問題，設(shè)計(jì)合成了硼酸功能化介孔納米材料用于選擇性富集糖肽。介孔材料MCM-41具有很大的比表面積(≈1000 m2/g)適合作為硼酸基團(tuán)改性修

8、飾的基底材料，而且其孔道尺寸(2.1～2.7 nm)和六方柱狀孔道結(jié)構(gòu)具有尺寸排阻效應(yīng)使其非常適合于多肽組的研究，硼酸功能化MCM-41則為其應(yīng)用于生物樣品中糖肽組的研究提供了可能。本章第一節(jié)中選取介孔納米材料MCM-41作為基底材料，在水相中對(duì)其進(jìn)行硼酸功能化表面改性，紅外表征，并對(duì)其用于糖肽富集的條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化，最終建立了一種硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-GLYMO-APB用于選擇性富集糖肽并用基質(zhì)輔助激光解吸附電離-四

9、極離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-QIT-MS)進(jìn)行糖肽分析的方法。本章第二節(jié)為了解決上述硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-GLYMO-APB在糖肽組研究中可能存在接枝效率不高以及不利于保持MCM-41六方柱狀孔道的有序介孔結(jié)構(gòu)的問題，我們改進(jìn)了材料的合成方法，又設(shè)計(jì)了在有機(jī)相中制備一種硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-APTES-CPB。采用多種技術(shù)手段對(duì)此材料進(jìn)行表征，并優(yōu)化了其用于糖肽富集的條件，使其同時(shí)具有更高的糖肽富集效

10、率、更高的糖肽富集特異性以及更高的質(zhì)譜兼容性。MCM-41-APTES-CPB在糖肽/非糖肽的摩爾比例達(dá)到1∶100時(shí)對(duì)糖肽仍然具有優(yōu)秀的選擇性，極好的靈敏度（檢出限為fmol級(jí)），良好的富集容量(40 mg/g-1)，以及很高的糖肽富集回收率(88.10％)。
　　第三章為了解決血清糖肽組研究中存在血清蛋白的高動(dòng)態(tài)范圍、蛋白質(zhì)組學(xué)傳統(tǒng)的樣品制備技術(shù)不能有效覆蓋低分子量蛋白、以及糖肽的相對(duì)低豐度的困難，建立了硼酸功能化介孔納米材料

11、用于高特異性揭示血清糖肽組的方法以克服當(dāng)前研究方法的不足。糖肽組研究中樣品的預(yù)處理方法不僅需要能有效提取多肽還必須對(duì)糖肽具有特異性。目前尚沒有能應(yīng)用于糖肽組研究的合適樣品前處理方法。本章在第二章研究的工作基礎(chǔ)上，利用介孔納米材料MCM-41的開口孔徑尺寸與多肽尺寸匹配的特點(diǎn)，結(jié)合MCM-41內(nèi)孔孔徑修飾硼酸基團(tuán)后可以快速高效富集糖肽的特點(diǎn)，建立了以生物質(zhì)譜為基礎(chǔ)的利用硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-APTES-CPB高特異性揭示大鼠

12、血清糖肽組的方法。對(duì)硼酸功能化介孔納米材料用于糖肽組研究的可能性進(jìn)行了驗(yàn)證，該制備的材料同時(shí)具有對(duì)糖肽合適的介孔孔徑以及豐富的硼酸基團(tuán)能特異性富集糖肽的性質(zhì)，大分子蛋白被排阻在孔徑外，糖肽則進(jìn)入孔道內(nèi)，從而特異性地富集血清中內(nèi)源性糖肽。將硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-APTES-CPB成功應(yīng)用于大鼠血清糖肽組的研究，富集并鑒定了15條內(nèi)源性糖肽以及對(duì)應(yīng)的15個(gè)糖基化位點(diǎn)。
　　第四章針對(duì)蛇毒糖肽組研究幾乎為空白的情況建立了利

13、用硼酸功能化介孔納米材料高特異性揭示蛇毒糖肽組的方法。盡管關(guān)于蛇毒蛋白質(zhì)組的研究快速增長(zhǎng)，蛇毒多肽組的鑒定卻沒有進(jìn)展很快，而蛇毒糖肽組則鮮有研究。為了高特異性揭示蛇毒糖肽組，我們建立了以生物質(zhì)譜為基礎(chǔ)的利用硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-APTES-CPB揭示蛇毒糖肽組的方法。為了驗(yàn)證該方法的有效性，我們將多肽組提取和糖肽富集研究中常用的技術(shù)結(jié)合，采用四種不同的方法，包括乙腈沉淀法、超濾法、乙腈沉淀結(jié)合肼樹脂富集法和超濾結(jié)合肼樹脂富

14、集法分別對(duì)蛇毒中的糖肽組進(jìn)行富集。結(jié)果表明，這五種方法中利用硼酸功能化介孔納米材料MCM-41-APTES-CPB富集蛇毒糖肽組的方法特異性最好（達(dá)到44％），富集糖肽的數(shù)目最多(11條糖肽)，且操作簡(jiǎn)便省時(shí)?？偣茶b定到十五條糖肽和十五個(gè)糖基化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于10個(gè)前體蛋白，這些糖肽均為首次被鑒定，高特異性揭示了蝰蛇蛇毒的糖肽組，并為其中八個(gè)前體蛋白在蛋白水平的存在提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。硼酸功能化介孔納米材料富集結(jié)合高精密度質(zhì)譜鑒定的新方法為蛇毒

15、中糖基化肽段的提取、釋放和鑒定建立了一種簡(jiǎn)單而有效的流程，這種技術(shù)在高度特異性發(fā)現(xiàn)作為具有潛在臨床藥物應(yīng)用價(jià)值的蛇毒糖肽方面非常具有發(fā)展?jié)摿Α?br>　　第五章將肼基樹脂和磁性納米材料各自的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，制備一種具有高密度肼基團(tuán)的磁性納米材料，使其既有豐富的肼基團(tuán)能夠高特異性富集糖肽，又有磁性內(nèi)核易于分離適用于更便捷的糖蛋白質(zhì)樣品處理，并用于腸癌病人血清中糖蛋白組的研究。先利用蒸餾沉淀聚合法將含有大量羧基末端的聚合物包覆至納米磁性核心表

16、面，再將己二酸二酰肼通過酰胺鍵鍵合至羧基聚合物磁性納米材料表面，得到肼功能化聚合物磁性納米復(fù)合材料(Fe3O4@PMAH)。此制備材料的肼基團(tuán)密度為154±11μmol/g，磁飽和值為25 emu/g，具有豐富的肼基團(tuán)和優(yōu)良的磁響應(yīng)。與肼樹脂相比，F(xiàn)e3O4@PMAH對(duì)于糖肽富集的信噪比提高了五倍以上。將Fe3O4@PMAH應(yīng)用于腸癌病人血清酶解物中糖肽的富集，三次實(shí)驗(yàn)操作測(cè)定的重現(xiàn)性良好，共鑒定到175條糖基化肽段，181個(gè)糖基化位點(diǎn)