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1、研究背景:膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,世界上每年診斷的膀胱癌超過(guò)200000例,每年約有12000人死于膀胱癌。在美國(guó),位于最常見(jiàn)的惡性腫瘤中的第4位,在我國(guó),發(fā)病率位于泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的第一位。膀胱癌90%以上為移行上皮細(xì)胞癌,15%左右的膀胱癌患者初診時(shí)即存在局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶,20%~30%表淺性膀胱癌術(shù)后將發(fā)展為浸潤(rùn)性或轉(zhuǎn)移性癌,根治性膀胱切除術(shù)后30%~40%的浸潤(rùn)性膀胱癌出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)期
2、療效不佳。特別是表淺性膀胱癌經(jīng)尿道切除后的高復(fù)發(fā)率已經(jīng)成為了治療中亟待解決的問(wèn)題。隨著自殺基因(suicide gene)系統(tǒng)對(duì)膀胱癌治療研究的逐步深入,大家逐漸認(rèn)識(shí)到自殺基因系統(tǒng)是一種發(fā)展前景良好的治療方法,但是也存在著如基因轉(zhuǎn)染效率低下,基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性差,各類(lèi)載體及自殺基因本身對(duì)機(jī)體的毒性和損傷作用,載體及腫瘤細(xì)胞殺死后引發(fā)的自身免疫反應(yīng),前體藥物代謝產(chǎn)物僅僅針對(duì)分裂期細(xì)胞等局限性。為了彌補(bǔ)自殺基因治療系統(tǒng)的不足,越來(lái)越多的學(xué)者都
3、在致力于研究將現(xiàn)有的治療方法和自殺基因治療系統(tǒng)相結(jié)合,以尋找對(duì)抗膀胱癌復(fù)發(fā)的新思路和新途徑。羥基喜樹(shù)堿(HCPT)、吡柔比星(THP)是目前臨床預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的膀胱灌注化療藥物。HCPT是從珙桐科植物喜樹(shù)(Camptotlaecaacuminata Decne)中提取得到的一種微量生物堿,抗瘤譜廣,能夠選擇性地抑制拓樸異構(gòu)酶而干擾DNA的復(fù)制,和其他抗腫瘤藥物無(wú)交叉耐藥,有良好的協(xié)同作用。利用HCPT這一特有的性質(zhì),結(jié)合TK基因聯(lián)合治療
4、膀胱癌的方法目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。THP是新一代半合成葸環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物,是在阿酶素的氨基糖4’端加了一個(gè)吡喃環(huán),使它抗腫瘤的活性、靶細(xì)胞的藥物濃度明顯提高,半衰期縮短,毒副作用明顯減少。它進(jìn)入細(xì)胞核,嵌入DNA的雙螺旋鏈,抑制DNA聚合酶A和B,阻止了核酸的合成,使腫瘤細(xì)胞不能進(jìn)行細(xì)胞分裂而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)采用HSV-TK系統(tǒng)聯(lián)合小劑量化療藥物(HCPT、THP)對(duì)人膀胱癌T-24進(jìn)行治療,并對(duì)其體外殺傷作用進(jìn)行比較,為自殺基因聯(lián)合
5、化療藥物治療膀胱癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 1、研究腺病毒介導(dǎo)的HSV-FK系統(tǒng)聯(lián)合小劑量羥基喜樹(shù)堿(HCPT)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的體外殺傷作用。 2、研究腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK系統(tǒng)聯(lián)合小劑量吡柔比星(THP)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的體外殺傷作用。 方法: 1、體外培養(yǎng)T-24細(xì)胞; 2、使用含有單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidinekinase,HS
6、V-TK)基因和綠色熒光蛋白(green fluorscent protein,GFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒(AdCMV-TIC,Adv)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,擴(kuò)增腺病毒;用綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定腺病毒滴度。 3、腺病毒感染人膀胱癌細(xì)胞T-24,獲取轉(zhuǎn)染TK基因的T-24細(xì)胞。分別提取人膀胱癌細(xì)胞T-24以及轉(zhuǎn)染TK基因T-24細(xì)胞RNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),電泳鑒定。 4、在體外培養(yǎng)T-24的細(xì)胞培養(yǎng)液中,加入HCP
7、T,HCPT濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、200mg/L,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定單純HCPT作用人膀胱癌細(xì)胞72h細(xì)胞增殖抑制率,確定。HCPT的有效作用濃度。 5、在體外培養(yǎng)T-24的細(xì)胞培養(yǎng)液中,加入THP,THP濃度為0、0.1、1、10、100mg/L,同樣采用MTT法測(cè)定單純THP作用人膀胱癌細(xì)胞72h細(xì)胞增殖抑制率,確定THP的有效作用濃度。 6、根據(jù)HCPT的有
8、效作用濃度,選擇對(duì)T-24細(xì)胞殺傷作用較小的濃度梯度(0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L)。同時(shí)根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果,確定使用對(duì)T-24細(xì)胞殺傷作用較小GCV濃度(0.25mg/ml)。以正常T-24細(xì)胞為空白對(duì)照,采用。MTT法測(cè)定各組治療轉(zhuǎn)染后人膀胱細(xì)胞24h、48h、72h細(xì)胞存活率。 7、根據(jù)THP的有效作用濃度,選擇對(duì)T-24細(xì)胞殺傷作用較小的濃度梯度(1、5、10、15、20mg/L)。聯(lián)合GCV(0.25
9、mg/ml)對(duì)轉(zhuǎn)染后人膀胱細(xì)胞進(jìn)行治療。以正常T-24細(xì)胞為空白對(duì)照,采用MTT法測(cè)定各組治療24h、48h、72h細(xì)胞存活率。 結(jié)果: 1、293細(xì)胞能大量擴(kuò)增腺病毒,純化后腺病毒滴度為1.58×10<'10>PFU/ml。 2、經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)染腺病毒的T-24細(xì)胞出現(xiàn)大小為234bp的TK基因片段,而未轉(zhuǎn)染腺病毒的T-24細(xì)胞未擴(kuò)增出相應(yīng)片段,表明感染腺病毒的T-24細(xì)胞有TK基因mRNA表達(dá)。
10、 3、隨著濃度的增高,HCPT對(duì)T-24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增高,HCPT濃度為0.01 mg/L時(shí)T-24生長(zhǎng)抑制率為13.63%,50 mg/L時(shí)T-24生長(zhǎng)抑制率為64.44%,當(dāng)HCPT濃度大于100 mg/L時(shí),抑制作用無(wú)明顯增加(P=0.117)。表明HCPT可以良好的抑制人膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)有濃度依賴性。 4、THP濃度小于1 mg/L,對(duì)T~24生長(zhǎng)抑制率小于30%,大于1 mg/L至100 mg/L,抑制曲
11、線明顯變陡,濃度為50 mg/L時(shí),抑制率為62.94%,濃度為100 mg/L時(shí),抑制率到達(dá)93.22%。隨著THP濃度的增加,對(duì)T-24細(xì)胞的抑制作用也明顯增強(qiáng)(P=0.00)。 5、GCV+HCPT各組和單獨(dú)使用GCV組相比,對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有明顯殺傷作用有明顯的增強(qiáng)(P=0.00),GCV+HCPT組隨HCPT濃度增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng),殺傷效率明顯增高。0.25mg/ml GCV單獨(dú)作用于轉(zhuǎn)染后的膀胱癌細(xì)胞72h后,細(xì)胞存活
12、率為54.40%,GCV(0.25mg/ml)+HCPT(1mg/L)組的細(xì)胞存活率僅為33.57%(P=0.00)。提示HSV-TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合小劑量HCPT能夠增強(qiáng)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T-24的殺傷作用,且優(yōu)于單一使用HSV-TK/GCV系統(tǒng)。6、GCV+THP各組對(duì)轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞作用72小時(shí)后也均較GCV組有顯著的增強(qiáng)(P=0.00),各組之間的殺傷效率隨著濃度梯度的增加也有明顯增高(P=0.00)。表明HSV-TK/GCV自殺系
13、統(tǒng)聯(lián)合小劑量THP治療時(shí),也能增強(qiáng)治療組的殺傷作用,并表現(xiàn)出和GCV+HCPT組相同的濃度、時(shí)間相關(guān)性。 結(jié)論: 1、腺病毒載體能有效的將HSV-TK基因?qū)肴税螂装┘?xì)胞中表達(dá); 2、羥基喜樹(shù)堿可以在體外對(duì)人膀胱癌T-24細(xì)胞進(jìn)行有效的殺傷; 3、吡柔比星可以在體外對(duì)人膀胱癌T-24細(xì)胞進(jìn)行有效的殺傷; 4、HSV-TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合小劑量化療藥物羥基喜樹(shù)堿能增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的體外
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