新型殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合物的制備及初步生物相容性評(píng)價(jià).pdf

1、隨著社會(huì)人口的增多，因創(chuàng)傷、骨髓炎、腫瘤或其他的骨疾病造成的骨缺損病例越來(lái)越多，因此對(duì)臨床植骨材料需求越來(lái)越大，大量需求推動(dòng)了人工骨的研究和發(fā)展。在眾多無(wú)機(jī)骨替代材料中，α-半水硫酸鈣擁有較多寶貴特性:良好的生物相容性、可降解吸收、骨傳導(dǎo)性等[1-4]，α-半水硫酸鈣晶須在降解的過(guò)程中能夠形成微酸性環(huán)境，且自身降解產(chǎn)生的鈣離子能夠促進(jìn)形成高鈣濃度環(huán)境，刺激成骨細(xì)胞促進(jìn)成骨[5]。硫酸鈣基骨水泥能隨意塑型，對(duì)組織和器官無(wú)刺激反應(yīng)，固化后留

2、下大量微孔，同時(shí)具備藥物載體的功能，既可填充治療骨缺損，又能抑制骨折感染，加速骨折愈合達(dá)到新骨再生目的。研究表明，鍶元素(Sr)是存在于人體中的一種微量元素，是一種親骨性的元素。人體中的99％以上的鍶元素都存在于人體的骨骼中，此外還有0.65％的鍶以離子的形式存在于人體的細(xì)胞液中，使鍶的濃度處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡。在新骨形成的過(guò)程中鍶離子會(huì)保持一個(gè)較高的濃度以促進(jìn)新骨的生成，當(dāng)新骨形成之后，離子在細(xì)胞液中和骨骼中保持一定的濃度以維持骨的正常

3、的功能[6]。它的作用機(jī)制在于增加成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中堿性磷酸酶的活性，同時(shí)抑制BMSCs向破骨細(xì)胞分化所必需的NF-κB受體活化因子[7-8]。在半水硫酸鈣中可加入一定量的鍶以保持局部鍶離子的濃度會(huì)對(duì)骨的修復(fù)起到促進(jìn)加強(qiáng)的作用，但是臨床應(yīng)用的過(guò)程中常常遇到的問(wèn)題是:含鍶半水硫酸鈣植入人體總之后，鍶離子會(huì)釋放過(guò)快，不能與骨新骨形成的速率相匹配。目前在臨床應(yīng)用過(guò)程中半水硫酸鈣完全降解的時(shí)間為6-9周，

4、遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于新骨形成的速率(12周），使得材料的降解速率快于新骨生成的速率，會(huì)導(dǎo)致骨缺損的區(qū)域出現(xiàn)一部分的空洞，從而會(huì)被纖維組織長(zhǎng)入，會(huì)影響到治療效果，不利于骨缺損的愈合。
　　因此，為了解決上述含鍶半水硫酸鈣降解速率過(guò)快和鍶離子釋放速率過(guò)快的問(wèn)題，需要對(duì)含鍶半水硫酸鈣進(jìn)行改進(jìn)。近些年殼聚糖及殼聚糖微球等衍生物的廣泛應(yīng)用得到提示，殼聚糖別名蟹殼素、殼多糖、幾丁質(zhì)等，它存在于微生物、低等植物菌類、藻類細(xì)胞、軟體動(dòng)物及昆蟲(chóng)的外殼和軟骨之中

5、。它經(jīng)過(guò)甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酰基能得到一種天然多糖，分子式為(C8H13NO5)，分子量在106左右，理論含氮量6.9％。殼聚糖分子結(jié)構(gòu)呈直鏈狀、極性強(qiáng)，可生成不同衍生物，而這些衍生物的性質(zhì)和用途也是大不相同。殼聚糖外形是白色或淡黃色半透明狀固體，可溶于大多數(shù)酸液如鹽酸、醋酸、苯甲酸等，溶于酸后發(fā)生酸催化水解反應(yīng)，水解成單糖和寡糖。但殼聚糖不溶于水和堿溶液，也不溶于硫酸和磷酸。殼聚糖無(wú)毒、無(wú)害、遇水易分解[9]，且能溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的乙酸溶液后

6、并能形成透明黏稠的膠體溶液，這是其重要的性質(zhì)之一。因殼聚糖特殊分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)使其能夠廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，例如抗微生物、止血材料、骨修復(fù)材料、抗黏連劑、免疫制劑，并且在食品、化工、環(huán)保等行業(yè)亦能應(yīng)用。
　　近幾年許多材料研究人員及大量文獻(xiàn)[10]報(bào)道有關(guān)殼聚糖修飾脂質(zhì)體、微球、微囊等遞藥系統(tǒng)。制備殼聚糖微球能夠改善易降解蛋白的生物利用度，增強(qiáng)親水性藥物通過(guò)上皮層的滲透性，以此來(lái)達(dá)到控制藥物釋放的目的。噴霧干燥法、共價(jià)交聯(lián)法、乳化

7、交聯(lián)法、離子凝膠法、復(fù)凝聚法等為常用殼聚糖微球制備方法。本研究目的是利用殼聚糖對(duì)含鍶半水硫酸鈣進(jìn)行包覆形成微球，使含鍶半水硫酸鈣的表面形成了一個(gè)殼層，有效的解決了半水硫酸鈣降解速率過(guò)快和遇大量體液易流失的問(wèn)題，同時(shí)使鍶能夠達(dá)到一個(gè)長(zhǎng)期穩(wěn)定的釋放效果。
　　本實(shí)驗(yàn)包括·兩部分，第一部分是殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合物的制備及其該材料進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其是否為該產(chǎn)物;第二部分依據(jù)關(guān)于（中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886）中提

8、到關(guān)于醫(yī)用生物材料（植入體）安全性評(píng)價(jià)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，按要求需要完成:(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(2)遺傳毒性試驗(yàn)(3)急性毒性試驗(yàn)(4)亞急性毒性試驗(yàn)(5)皮膚刺激試驗(yàn)(6)皮內(nèi)致敏試驗(yàn)(7)皮下肌肉植入實(shí)驗(yàn)，需完成以上國(guó)家要求生物材料標(biāo)準(zhǔn)來(lái)初步評(píng)價(jià)殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合材料的生物相容性，為該材料的最終應(yīng)用提供生物安全方面的依據(jù)。
　　第一部分殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合物的制備
　　目的:制備殼聚糖包裹含鍶α-半

9、水硫酸鈣微球復(fù)合物并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證是否為該產(chǎn)物。
　　材料與方法:首先采用共結(jié)晶的方法制各了含鍶二水硫酸鈣，然后利用常壓鹽溶液法制備出了含鍶半水硫酸鈣，最后在PH=5條件下利用殼聚糖溶液和含鍶半水硫酸鈣之間的靜電引力在高速攪拌條件下制備出了殼聚糖包覆含鍶半水硫酸鈣微球。
　　結(jié)果:成功制備殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合物，其XRD結(jié)果顯示，XRD分析結(jié)果顯示2θ=14.75、25.71、29.76、31.91分別對(duì)

10、應(yīng)著典型的α-CSH晶體的的(110)、(310)、(220)、（-114）晶面，說(shuō)明鍶離子的加入對(duì)CSH的結(jié)晶性能沒(méi)有影響，CSH保持了其良好的結(jié)晶性能和其本身具有的優(yōu)良特性。此外，CS-C-CSH(Sr)峰的強(qiáng)度與CSH(Sr)相比較弱，其可能的原因是在其表面包覆了一層殼聚糖，因而影響了信號(hào)的強(qiáng)度;SEM結(jié)果顯示，從左圖可以看出CSH(Sr)呈長(zhǎng)棒狀結(jié)構(gòu)，且其長(zhǎng)度均勻，平均長(zhǎng)度約等于50um。右圖為CS-C-CSH(Sr)微球，從圖

11、中可以看出經(jīng)殼聚糖包覆以后，CSH(Sr)呈類球形，這是因?yàn)镃SH(Sr)呈棒狀結(jié)構(gòu)，殼聚糖很難將其包覆成規(guī)則的球形，且從圖中還可以看出，微球的直徑在60um左右，且粒徑基本一致，這有助于后期鍶離子的均勻的釋放。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)制備出的殼聚糖包覆含鍶α-半水硫酸鈣微球粒徑均勻，且在反應(yīng)過(guò)程中無(wú)任何的有機(jī)溶劑，保證了微球的安全性。
　　第二部分殼聚糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合材料的生物相容性
　　目的:初步評(píng)價(jià)殼聚

12、糖包裹含鍶α-半水硫酸鈣微球復(fù)合材料的生物相容性，為該材料的最終應(yīng)用提供生物安全方面的依據(jù)。
　　材料與方法:(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)估材料浸提液對(duì)L-929小鼠成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)及相對(duì)增殖率的影響。(2)皮膚刺激試驗(yàn)(3)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)(4)體內(nèi)植入試驗(yàn)評(píng)估其對(duì)活體組織局部毒性反應(yīng)。(5)皮下致敏試驗(yàn)(6)急性毒性試驗(yàn)(7)亞急性毒性試驗(yàn)
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的毒性反應(yīng)均為0-Ⅰ級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒

13、性;而陽(yáng)性對(duì)照組毒性反應(yīng)均為Ⅲ級(jí)，有細(xì)胞毒性;(2)微核率均在文獻(xiàn)報(bào)道正常值范圍內(nèi)，說(shuō)明浸提液未使小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率發(fā)生顯著改變，各劑量組PCE/NCE不少于對(duì)照組的20％，屬正常范圍;(3)體內(nèi)植入結(jié)果表明材料和機(jī)體達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。(4)皮內(nèi)致敏實(shí)驗(yàn)中，觀察試驗(yàn)鼠注射局部和周圍皮膚組織反應(yīng)，試驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)的B點(diǎn)皮膚區(qū)域均未出現(xiàn)紅斑、水腫和壞死，表明材料浸提液對(duì)皮膚無(wú)刺激作用，都符合皮內(nèi)致敏試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。(5)皮膚刺激試驗(yàn)的浸提液

14、組所觀察與陰性對(duì)照組一致，未見(jiàn)皮膚水腫，皮膚棘細(xì)胞層水腫，血管周圍、彌漫的真皮和表皮單核細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)散在少量的嗜堿性細(xì)胞。(6)急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物反應(yīng)比較對(duì)照組動(dòng)物反應(yīng)基本一致，未見(jiàn)明顯差別，小鼠活動(dòng)及進(jìn)食良好，呼吸正常，無(wú)癱瘓、驚厥及死亡發(fā)生，各方面表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)組相同。小鼠尾靜脈注射后體重穩(wěn)定，部分略有增加。(7)亞急性毒性試驗(yàn)中，浸提液組相比較生理鹽水組動(dòng)物反應(yīng)基本保持一致，末出現(xiàn)明顯的差別。