聚乳酸-殼聚糖-納米銀紡絲纖維的制備及特性研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一章 聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維的制備
　　目的：
　　采用靜電紡絲技術(shù)制備聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維，在掃描電鏡下觀察纖維結(jié)構(gòu)，并在纖維的正反面分別噴上殼聚糖溶液及納米銀顆粒，觀察殼聚糖存在形態(tài)及納米銀在纖維表面的分布。在能譜儀上檢測(cè)銀元素含量。
　　方法：
　　1.將聚乳酸溶解在三氯甲烷中進(jìn)行電紡，真空干燥過(guò)夜。殼聚糖通過(guò)靜電紡絲技術(shù)噴涂到純聚乳酸膜上，再次真空

2、干燥。將納米銀以1mg/mL超聲分散噴灑在殼聚糖膜的另外一面，風(fēng)干。
　　2.在纖維表面噴金后，掃描電鏡觀察表面形態(tài)，計(jì)算直徑。觀察殼聚糖及納米銀納米顆粒在材料上的分布情況。
　　3.聚乳酸表面噴灑上納米銀納米粒后，在能譜儀下選取納米銀納米粒分布區(qū)域，檢測(cè)該區(qū)域銀元素的含量。
　　結(jié)果：
　　1.掃描電鏡圖像顯示純聚乳酸纖維表面呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維直徑約500nm到1.3μm。殼聚糖以納米顆粒的形式分散在聚乳酸纖維上

3、，殼聚糖比例增加，殼聚糖納米粒相互融合。
　　2.納米銀以納米顆粒的形式分散在殼聚糖的另一面。能譜結(jié)果顯示銀元素含量大約33％。
　　第二章 聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維的機(jī)械性能研究
　　目的：
　　檢測(cè)制備聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維的機(jī)械性能如彈性模量、斷裂伸長(zhǎng)率以判斷該材料是否能滿足臨床的需要;檢測(cè)水的接觸角，以觀察殼聚糖涂層對(duì)材料親水性的影響，初步判斷對(duì)細(xì)胞親和性能的影響;檢測(cè)材料的降解性能，以了解

4、該材料的降解速率。
　　方法：
　　1.斷裂伸長(zhǎng)率、彈性模量:將4組靜電紡絲纖維剪成1mm×20mm的規(guī)格，每組樣品20個(gè)，置于力學(xué)拉伸機(jī)上行單軸拉伸試驗(yàn)，檢測(cè)彈性模量，斷裂伸長(zhǎng)率。
　　2.接觸角檢測(cè):將4組靜電紡絲纖維剪成5mm×5mm的規(guī)格，每組樣品10個(gè)。滴加墨水稀釋液，在立體顯微鏡下進(jìn)行攝影，取30秒的圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　3.降解性能檢測(cè):將4組靜電紡絲纖維剪成50mg每張，放置在50mL PBS緩沖液

5、中，37℃孵育。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)換液，干燥并稱重。
　　結(jié)果：
　　1.機(jī)械性能結(jié)果顯示:純聚乳酸紡絲經(jīng)殼聚糖表面改性后，彈性、斷裂伸長(zhǎng)率有所上升。
　　2.接觸角結(jié)果顯示:純聚乳酸呈現(xiàn)明顯的疏水性，接觸角大，經(jīng)殼聚糖改性后，親水性提高，接觸角變小。
　　3.降解性能檢測(cè):純聚乳酸降解性小，經(jīng)殼聚糖改性后，降解性增加，并且隨殼聚糖比例的增加而增加。
　　第三章 聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維的生物學(xué)性能研究<

6、br>　　目的：
　　研究聚乳酸/殼聚糖/納米銀的聚乳酸/殼聚糖纖維面對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、礦化的影響;對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑菌增殖的影響;對(duì)人牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。探索制備的紡絲纖維的各項(xiàng)生物學(xué)性能。
　　方法：
　　1.檢測(cè)納米銀顆粒最小抑菌溶度，酶標(biāo)儀法測(cè)納米銀最小抑菌溶度。
　　2.檢測(cè)聚乳酸/殼聚糖/納米銀抑菌率。
　　3.聚乳酸/殼聚糖/納米銀對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響:靜電紡絲纖維膜剪成

7、直徑約10mm的圓形。細(xì)胞以一定密度接種，分組:純聚乳酸，殼聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5)，細(xì)胞直接接種在24孔板為參照。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5、7天用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　4.聚乳酸/殼聚糖/納米銀對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞礦化的影響:細(xì)胞以一定密度接種，分組:純聚乳酸，殼聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5)，以細(xì)胞直接接種在24孔板為參照。37℃、5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天用茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞礦化情況。R

8、T-PCR檢測(cè)OPG與RUNX2 mRNA表達(dá)。
　　5.培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞。
　　6.角蛋白、波形絲蛋白染色:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代hPDLCs以一定密度接種至底部放有載玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24小時(shí)后PBS沖洗3次，多聚甲醛固定30分鐘，取出載玻片進(jìn)行角蛋白、波形絲蛋白染色。
　　7.MTT法檢測(cè)hPDL殼聚糖的細(xì)胞活性。
　　8.聚乳酸/殼聚糖/納米銀對(duì)牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)影響:靜電紡絲纖維膜剪成直徑約10m

9、m的圓形。接種細(xì)胞，分組:純聚乳酸，殼聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5)，以細(xì)胞直接接種在24孔板為參照。第7天提取細(xì)胞總mRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.抑菌結(jié)果顯示:納米銀顆粒50μg/mL抑菌率約90％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.聚乳酸/殼聚糖/納米銀抑菌率的檢測(cè):不同比例組成的靜電紡絲纖維與納米銀混合后，不降低納米銀的抑菌率。
　　3.MTT結(jié)果顯示:骨髓

10、基質(zhì)干細(xì)胞在支架材料上能以比較快的速度增長(zhǎng)，其中在第1天、3天與空白對(duì)照組OD值有明顯的升高，第5天、7天實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比增殖速率均在75％以上，屬于無(wú)毒性材料。
　　4.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示:聚乳酸/納米銀纖維與空白對(duì)照組無(wú)明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，經(jīng)殼聚糖改性后，礦化結(jié)節(jié)形成明顯增加，并且隨殼聚糖比例的增加有所增加。經(jīng)殼聚糖表面改性后，礦化基因的表達(dá)比純聚乳酸/納米銀及空白對(duì)照組明顯增加。
　　5.原代hP

11、DLCs培養(yǎng):改良酶消化法分離培養(yǎng)hPDLCs6-9天可見細(xì)胞游離出組織塊。形態(tài)學(xué)觀察顯示:游出細(xì)胞為典型成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，細(xì)胞為梭形或星形，體積較大。傳代細(xì)胞為不規(guī)則圓形、多角形、梭形，且成放射狀增殖。
　　6.hPDLCs炎癥因子表達(dá):紡絲纖維可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞TLR4、IL-6、IL-8、IL-1β mRNA表達(dá)。
　　第四章 聚乳酸/殼聚糖/納米銀紡絲纖維促炎反應(yīng)機(jī)制的初步探討
　　目的：
　　觀察TLR4

12、的沉默對(duì)細(xì)胞MyD88/NF-κB及炎癥因子表達(dá)的影響。并探索TLR4沉默對(duì)接種于支架材料的牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。以探索結(jié)合靶向調(diào)控TLR4表達(dá)的藥物的可行性。
　　方法：
　　1.TLR4慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞感染:將含有目的序列的穿梭質(zhì)粒及三種輔助包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G，利用RNAi-mate進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，離心后得到高滴度的慢病

13、毒濃縮液。通過(guò)GFP熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定濃縮病毒液的滴度。
　　2.TLR4沉默效率檢測(cè):取狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的第3代hPDLCs接種于6孔板，24小時(shí)細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分4組，分別加入2μL的polybrene和劑量的慢病毒(MOI=50、MOI=80)。第4天經(jīng)RT-PCR及Western Blot檢測(cè)TLR4表達(dá)。
　　3.TLR4沉默對(duì)MyD88、NF-κB表達(dá)影響:按上述方法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒(MOI=50、M

14、OI=80)。RT-PCR及Western Blot檢測(cè)MyD88、NF-κB表達(dá)。
　　4.TLR4沉默對(duì)hPDLCs炎癥因子表達(dá)的影響:按上述方法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒(MOI=50、MOI=80)。RT-PCR檢測(cè)IL-1、IL-6、IL-1β表達(dá)。
　　5.TLR4沉默對(duì)靜電紡絲纖維導(dǎo)致炎癥因子過(guò)表達(dá)影響:靜電紡絲纖維膜剪成直徑約10mm的圓形，接種細(xì)胞。陰性對(duì)照組:純聚乳酸/納米銀，殼聚糖/聚乳酸(1/9、3/7

15、、5/5)/納米銀，第2天加入NC-shRNA;實(shí)驗(yàn)組:純聚乳酸/納米銀，殼聚糖/聚乳酸(1/9、3/7/5∶5)/納米銀，加入TLR4-shRNA。第7天提取細(xì)胞總mRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒滴度檢測(cè)結(jié)果:TLR4-shRNA及NC-shRNA慢病毒滴度均為109TU/mL。
　　2.TLR4沉默效率的檢測(cè):慢病毒轉(zhuǎn)染人牙周膜細(xì)胞48小時(shí)，可見細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出

16、綠色熒光;RT-PCR及Western Blot顯示構(gòu)建的慢病毒能有效沉默TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　3.MyD88、NF-κB檢測(cè):RT-PCR及Western Blot顯示TLR4沉默后可直接下調(diào)MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)。
　　4.hPDLCs炎癥因子檢測(cè):RT-PCR結(jié)果顯示TLR4沉默后可直接下調(diào)IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的表達(dá)。
　　5.TLR4沉默對(duì)紡絲纖維促炎作用的

17、影響:RT-PCR結(jié)果顯示TLR4沉默后可下調(diào)靜電紡絲纖維引起的牙周膜細(xì)胞TLR4、IL-6、IL-8、IL-1β mRNA表達(dá)升高。
　　結(jié)論：
　　1.制備的聚乳酸靜電紡絲纖維直徑均勻，殼聚糖低比例時(shí)以納米顆粒的形式分布，高比例時(shí)互相融合。納米銀納米粒均勻分布于聚乳酸表面。
　　2.聚乳酸/殼聚糖纖維膜機(jī)械性能基本滿足臨床需求，殼聚糖涂層可提高材料的機(jī)械性能、降解速度及親水性能。
　　3.制備的材料生物學(xué)性能