兩種體系中的15-羥基十五烷酸甲酯酶催化合成環(huán)十五內(nèi)酯及動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、環(huán)十五內(nèi)酯屬于大環(huán)內(nèi)酯香料的一種,它在香水、精細(xì)化工品、食品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。中國(guó)廣西特產(chǎn)植物蒜頭果的油脂中含有50％的二十四碳-15-烯酸,它是合成麝香類香料—環(huán)十五內(nèi)酯的理想原料。很多化學(xué)方法已經(jīng)成功合成了環(huán)十五內(nèi)酯,但能耗大,反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)阻礙了其工業(yè)化生產(chǎn)。脂肪酶作為一種生物催化劑,在溫和的條件下具有高效、高選擇性及高特異性的催化作用,被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、精細(xì)化工及食品加工等領(lǐng)域,有關(guān)脂肪酶催化合成大環(huán)內(nèi)酯方面的研究已有幾

2、十年,但酶催化合成環(huán)十五內(nèi)酯的研究一直未受到關(guān)注。
　　 本文以自行篩選到的微生物產(chǎn)脂肪酶,催化蒜頭果為原料制得15-羥基十五烷酸甲酯合成環(huán)十五內(nèi)酯。主要開(kāi)展了五個(gè)方面的研究:(1)脂肪酶菌株的篩選及正交法優(yōu)化發(fā)酵條件;(2)將粗脂肪酶純化為層析純的酶;(3)酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求取及動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo);(4)有機(jī)溶劑體系與水/有機(jī)溶劑兩相體系中酶催化反應(yīng)的對(duì)比及反應(yīng)條件的優(yōu)化;(5)兩種體系中酶催化反應(yīng)歷程的推斷。
　　

3、實(shí)驗(yàn)篩選到10株高產(chǎn)脂肪酶菌株,其中經(jīng)紫外誘變后的菌株Candidasp.GXU08(簡(jiǎn)稱GXU08)對(duì)15-羥基十五烷酸甲酯轉(zhuǎn)化為環(huán)十五內(nèi)酯具有良好的催化性能。通過(guò)正交試驗(yàn),得到菌株最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件為:蔗糖0.5％,淀粉0.5％,蛋白胨1.5％,K2HPO40.05％,MgSO40.15％,(NH4)2SO41％,茶油1.5％,菜籽油1.5％,pH=8.5,發(fā)酵時(shí)間48h,其中發(fā)酵時(shí)間、蛋白胨、茶油和pH值對(duì)發(fā)酵液酶活的影響較

4、顯著。該優(yōu)化條件下所得發(fā)酵液的酶活為27.53U·mL-1,是優(yōu)化前的3.74倍。
　　 實(shí)驗(yàn)分別采用硫酸銨分級(jí)沉淀、CM-陽(yáng)離子纖維素柱層析、Sephacryl-S400凝膠層析及Sephadex-G100凝膠層析分離純化GXU08脂肪酶,純化后只出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰,得到了層析純的酶,且分離出的脂肪酶具有較高的內(nèi)酯化能力,可為今后研究酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　 發(fā)酵液經(jīng)40％～70％的(NH4)2SO4分級(jí)沉淀粗

5、分離后,酶比活力為14.50U·mg-1,純化倍數(shù)為1.27,酶活回收率為89.25％;經(jīng)CM-離子交換層析分離后,出現(xiàn)了3個(gè)較明顯的蛋白峰,酶比活力為49.50U·mg-1,純化倍數(shù)為4.33,酶活回收率為70.49％;經(jīng)Sephacryl-D400凝膠層析分離后,出現(xiàn)了2個(gè)明顯的蛋白峰,酶比活力提高到154.50U·mg-1,純化倍數(shù)為13.48,酶活回收率為53.28％;經(jīng)Sephadex-G100凝膠層析純化后只出現(xiàn)1個(gè)蛋白峰,

6、酶比活力提高到344.97U·mg-1,純化倍數(shù)為30.10,酶活回收率為41.75％。
　　 推導(dǎo)出GXU08脂肪酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為:v=2.413×10-6[S]/1.86+[S](其中v的單位是mol·L-1min-1,[S]的單位是mmol·L-1),計(jì)算得出米氏常數(shù)Km=1.86mmol·L-1,最大反應(yīng)速度Vmax=2.413×10-6mol.L-1·min-1。驗(yàn)證結(jié)果表明:實(shí)際反應(yīng)速度可以較好的與米氏模型相

7、吻合,表明該酶催化反應(yīng)符合推導(dǎo)出的動(dòng)力學(xué)方程。
　　 探討了有機(jī)溶劑體系中的酶催化反應(yīng),得到最佳反應(yīng)條件為:濃度為8mmol·L-1的底物,于40℃,180r·min-1,pH=6.5,酶活為1600U酶粉的作用下,在環(huán)己烷中反應(yīng)72h,環(huán)十五內(nèi)酯的生成量最大。實(shí)驗(yàn)證明:溶劑的介電常數(shù)越大,單位酶活生成環(huán)十五內(nèi)酯的質(zhì)量越小,反之亦然。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:酶在疏水介質(zhì)環(huán)己烷中表現(xiàn)出最佳催化能力,且GXU08脂肪酶對(duì)15-羥基十五烷酸甲酯

8、具有很好的專一性。
　　 首次將超聲波振蕩應(yīng)用于有機(jī)溶劑體系和水/有機(jī)溶劑兩相體系的酶催化合成環(huán)十五內(nèi)酯的反應(yīng)中,取得了較好的催化效果。兩相體系的最適反應(yīng)條件為:0.5mL,2.0g·mL-1的脂肪酶酶液,在超聲波震蕩下均勻分散于pH=7.0的8mmol·L-115-羥基十五烷酸甲酯的環(huán)已烷溶液中,于40℃,180r·min-1的搖床中反應(yīng)72h,其單位酶活所得環(huán)十五內(nèi)酯的質(zhì)量最大為50.284×10-5mg.U-1,而優(yōu)化條件

9、下的純有機(jī)溶劑體系中僅為29.02×10-5mg.U-1,前者為后者的1.733倍。
　　 研究還發(fā)現(xiàn),兩相體系中分別將脂肪酶和反應(yīng)體系重復(fù)使用一次,均可較大地提高環(huán)十五內(nèi)酯的產(chǎn)量。且在相同的反應(yīng)條件下,酶液比酶粉具有更高的催化合成環(huán)十五內(nèi)酯的能力。故可直接使用一定濃度的經(jīng)硫酸銨沉淀后的酶液代替酶粉催化合成環(huán)十五內(nèi)酯,既可省卻冷凍干燥的過(guò)程,又可提高環(huán)十五內(nèi)酯的產(chǎn)量。
　　 此外,實(shí)驗(yàn)得出有機(jī)相中的酶催化反應(yīng)為:()表明