大型溞ChE免疫測定：有機磷殺蟲劑的生物指示.pdf

1、本文探索了從大型溞體內提取和純化ChE的適宜條件，在此基礎上按此對酶進行了分離提純，得到了基本達電泳純的大型溞ChE，進而對其性質進行了初步的了解，檢測了ChE的底物特異性以及抗抑制性。通過將純化的大型溞ChE免疫小鼠，得到了較高效價的小鼠多克隆抗血清，從而建立了能夠定量測定大型溞體內微量的ChE-IR的間接非競爭ELISA法，并利用所建立的方法進行了一些活體測定。主要研究成果如下：
　　 通過提取和純化大型溞ChE的適宜條件的

2、摸索，確定了大型溞ChE粗提取純化的最佳條件組合是：pH7.5、0.25％(V/V)Triton X-100、60％～100％硫酸銨沉淀；經過超聲破碎、Triton X-100提取、硫酸銨鹽析和DEAE-Sephrose-Fast-Flow陰離子柱層析，一種純度已達電泳純的ChE被成功從大型溞體內分離出來。以粗提物為起點，該純化過程對酶的純化倍數和純化回收率分別為62倍和19％，大約有400ug左右的比活力為330.8U/mg prot

3、ein的ChE被從4g左右的大型溞體內純化出來。該酶的分子量經測定為84KDa。底物特異性研究表明，此酶既能水解ATCh，也能水解BTCh，以ATCh和BTCh為底物，Km和Vmax分別為0.1498mmol/L、0.1098U/mL和0.2878mmol/L、0.1348U/mL，對ATCh大于BTCh；并且出現(xiàn)高濃度底物抑制現(xiàn)象?？挂种菩栽囼灡砻鳎惶峒兊腃hE對iso-OMPA的敏感性明顯高于BW284C51。以上種種結果表明所純

4、化出的ChE為非典型的丁酰膽堿酯酶(PChE)。
　　 本論文第一次證實大型溞體內含有不止一種形式的膽堿酯酶，其中0～45％飽和度硫酸銨沉淀組分中主要含有AChE形式的膽堿酯酶；而60％～100％飽和度硫酸銨沉淀組分中主要含有PChE形式的膽堿酯酶。
　　 用純化的大型溞ChE免疫BALB/c小鼠后，得到效價達1：8000的多克隆抗血清，抗原抗體最適工作濃度測定結果顯示最適抗原濃度為6ug/mL，抗血清最適稀釋倍數是1：

5、8000；建立了測定大型溞ChE-IR的標準曲線：Y=a(1-e-bx)，其中a=1.6469638，b=0.13443779，相關系數r=0.99444916，標準誤差S=0.07151367；建立的間接非競爭ELISA方法在不同蛋白濃度的批內、批間和整體的變異系數均小于10％，靈敏度為0.24ng/mL，回收率介于92.9～102％之間，達到了ELISA質量控制要求。本實驗獲得的抗血清與非膽堿酯酶類的Marker和其他生物(搖蚊、斑

6、馬魚、家蠶、蜜蜂、蚯蚓、非洲爪蟾蝌蚪等)的ChE交叉反應率低。在抗原特異性方面，本實驗證明大型溞體內ChE不與多肽合成的N端和C端兔Anti-BChE抗體反應?？梢姕y定大型溞體內ChE的間接非競爭ELISA方法特異性高，本研究的意義在此得到體現(xiàn)。
　　 利用間接非競爭ELISA方法的活體測定中，樣品25℃放置一周，酶活性失活顯著，隨著酶活性的失活，總蛋白含量和ChE-IR也呈下降趨勢，但是ChE-IR下降趨勢較為緩慢，可見ChE

7、-IR是一個比較穩(wěn)定的測試指標；通過測定10℃和25℃下培養(yǎng)的大型溞體內的ChE-IR以及酶活性，可以明顯的看出10℃培養(yǎng)的大型溞體內ChE-IR明顯提高，比25℃高將近10倍，經過LSD顯著性分析，5％水平上具有顯著性差異。可見低溫對大型溞體內ChE產生了誘導。對ChE合成的刺激應該是生物體對有機磷和低溫脅迫的一種適應機制；毒性試驗表明，三唑磷和氰戊菊酯對大型溞急性毒性48-LC50值分別為0.00174mg/L和0.000900mg

8、/L。在0.00033mg/L(大約為48-LC50值的1/5)三唑磷的脅迫下，大型溞體內ChE-IR受誘導現(xiàn)象比較明顯，第6d誘導率為72.4％，與CK和其它兩個處理(0.001mg/L和0.002mg/L)差異顯著。非ChE抑制劑的氰戊菊酯在所測濃度(0.000014mg/L、0.0000187mg/L、0.00002mg/L)范圍內，對大型溞體內ChE-IR均無明顯誘導。并且得出以酶蛋白含量衡量酶活性是符合生物規(guī)律并且比較準確的生