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文檔簡(jiǎn)介
1、第一章、毒死蜱對(duì)高脂飲食致免AS形成的影響及相關(guān)機(jī)制研究
目的:
探討毒死蜱對(duì)高脂飲食致動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及相關(guān)機(jī)制。
方法:
1.32只健康雄性新西蘭兔隨機(jī)分為如下四組(n=8):對(duì)照組、毒死蜱組、高脂飲食組、高脂飲食+毒死蜱組。高脂飲食配方為通用配方,毒死蜱的劑量為(20 mg/kg/d,毒死蜱兔的口服LD50為1000-2000 mg/kg),連續(xù)觀察6個(gè)月。
2、 2.動(dòng)物處死前從耳緣靜脈取血并分離出血清儲(chǔ)存,用于檢測(cè)血脂水平和膽堿酯酶(AChE)、對(duì)氧磷酶1(PON1)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)的含量,及相關(guān)肝、腎功能指標(biāo)。
3.收集并培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞,測(cè)定其膽固醇流出率。
4.切取一段胸主動(dòng)脈采用離體血管環(huán)灌流法檢測(cè)血管舒縮功能。
5.采用蘇丹Ⅳ染色法觀察胸主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,計(jì)算斑塊與血管內(nèi)皮表面積的百分比。頸總動(dòng)脈、主
3、動(dòng)脈弓作石蠟切片,用以觀察血管的形態(tài)學(xué)變化。
6.采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡法分別檢測(cè)肝、血管組織和腹腔巨噬細(xì)胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)的表達(dá)以及肝臟PON1的表達(dá)。
結(jié)果:
1.高脂飲食6個(gè)月,其血漿總膽固醇和脂蛋白水平明顯升高,SOD活性降低,而MDA水平升高,其肝臟、主動(dòng)脈和腹腔巨噬細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)升高,腹腔巨噬細(xì)胞中膽固醇流出增加,肝臟中PON1的表達(dá)降低,與對(duì)
4、照組相比,均有顯著性差異;其主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。但血清AChE有輕度升高,但無顯著性差異。
2.毒死蜱組兔血清AChE和PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,與對(duì)照組比較有顯著性差異;肝腎功能指標(biāo)與對(duì)照組比,無顯著性差異。主動(dòng)脈和腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)、肝臟PON1的表達(dá)均有降低,腹腔巨噬細(xì)胞中膽固醇流出減少,與對(duì)照組比較有顯著性差異。
3.高脂飲食+毒死
5、蜱組PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,主動(dòng)脈和腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)、肝臟PON1的表達(dá)均有降低,腹腔巨噬細(xì)胞中膽固醇流出減少,與單高脂飲食組或毒死蜱組相比,上述指標(biāo)的改變更明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異。主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈粥樣硬化斑塊更加明顯。但血清AChE無明顯改變。
結(jié)論:
亞毒性劑量的毒死蜱可加快高脂飲食致動(dòng)脈粥樣硬化形成,加重血清中總膽固醇、脂蛋白、及其它生化指標(biāo)的改變,
6、其機(jī)制可能與毒死蜱消耗有抗氧化作用的PON1和降低其活性,從而間接或直接觸發(fā)氧化應(yīng)激,損傷內(nèi)皮功能,降低體內(nèi)ABCA1的表達(dá),繼而減少膽固醇流出有關(guān)。
第二章、對(duì)氧磷促鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成及機(jī)制探討
目的:
探討對(duì)氧磷對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成及相關(guān)機(jī)制
方法:
1.將RAW264.7巨噬細(xì)胞,分為下例5組:(1)對(duì)照組,(2)Ox-LDL泡
7、沫細(xì)胞模型組,(3-5)組分別為Ox-LDL+對(duì)氧磷(1、10和100μmol/1)組。各組細(xì)胞置5%CO2培養(yǎng)箱,37℃,常規(guī)培養(yǎng)72 h。
2.油紅染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)水平,及膽固醇流出率。
3.采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡法分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD36、ABCA1、和?;o酶A膽固醇?;D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)的表達(dá)。
結(jié)果:
8、 1.Ox-LDL處理48 h后,與正常巨噬細(xì)胞相比,油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加,細(xì)胞體積明顯增大,形態(tài)多呈圓形或不規(guī)則形;對(duì)氧磷(10,100μ mol/l)組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞比Ox-LDL模型組形態(tài)學(xué)改變更明顯,細(xì)胞體積明顯增大,而對(duì)氧磷(1μ mol/l)組細(xì)胞與模型組相比沒有顯著性差異。
2.泡沫細(xì)胞模型組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平顯著高于對(duì)照組,且CE/TC有顯著性差異;對(duì)氧磷(10,100μmol/
9、l)組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC均有顯著性增加,與泡沫細(xì)胞模型組相比,有顯著性差異,對(duì)氧磷(1μmol/l)組TC、FC、CE與泡沫細(xì)胞模型組差異無顯著性。
3.Ox-LDL泡沫細(xì)胞模型組細(xì)胞膽固醇流出率顯著性增加,與對(duì)照組相比,有顯著性差異;對(duì)氧磷(10和100μmol/l)組細(xì)胞膽固醇流出率顯著性降低,與泡沫細(xì)胞模型組相比,有顯著性差異;對(duì)氧磷(1μmol/l)處理組與泡沫細(xì)胞模型組相之間無顯著性差異。
10、r> 4.Ox-LDL刺激的泡沫細(xì)胞組與對(duì)照組比CD36 mRNA表達(dá)顯著增加,Ox-LDL刺激的泡沫細(xì)胞加對(duì)氧磷(10和100μmol/l)組與泡沫細(xì)胞組相比CD36 mRNA表達(dá)顯著增加。對(duì)氧磷(1μmol/l)處理組與泡沫細(xì)胞模型組相比沒有顯著性差異。
5.泡沫細(xì)胞模型組ABCA1表達(dá)較對(duì)照組顯著增加;與模型組相比,對(duì)氧磷(10和100μmol/1)顯著地下調(diào)了泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá),而對(duì)氧磷(1μmol/
11、l)沒有影響泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。
6.泡沫細(xì)胞模型組ACAT1mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增加;與模型組相比,對(duì)氧磷(10和100μmol/l)組顯著地增加了泡沫細(xì)胞中ACAT1的表達(dá),而對(duì)氧磷(1μmol/l)處理組沒有明顯增加泡沫細(xì)胞的ACAT1mRNA表達(dá)。
結(jié)論:
對(duì)氧磷能加速Ox-LDL誘導(dǎo)的鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成。其機(jī)制可能與對(duì)氧磷上調(diào)泡沫細(xì)胞中CD36和ACAT1表達(dá)而降低
12、ABCA1的表達(dá)有關(guān)。
第三章、對(duì)氧磷通過干預(yù)cAMP信號(hào)通路下調(diào)鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)和膽固醇流出
目的:
探討對(duì)氧磷下調(diào)鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)和膽固醇流出的機(jī)制
方法:
1.將Ox-LDL刺激形成的鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞分為以下組:(1)對(duì)照組,(2)對(duì)氧磷處理組:對(duì)氧磷(1,10和100μmol/l)孵育泡沫細(xì)胞24 h;對(duì)氧磷(10
13、0μmol/1)孵育泡沫細(xì)胞(6,12,24)h。
2.高效液相色譜法測(cè)定測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC及FC水平,計(jì)算CE,測(cè)定膽固醇流出率。
3.采用ELISA法檢測(cè)泡沫細(xì)胞內(nèi)cAMP水平、腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二脂酶的活性。
4.采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡分別檢測(cè)泡沫細(xì)胞中ABCA1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
結(jié)果:
1.對(duì)氧磷以時(shí)間和劑量依賴的方式增加RAW264.7巨噬細(xì)胞
14、源性泡沫細(xì)胞中TC、FC和CE水平,降低ABCA1表達(dá)和膽固醇流出。
2.對(duì)氧磷降低了細(xì)胞中cAMP的水平及腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性和增加磷酸二酯酶(PDE)的活性。
3.cAMP的類似物雙丁酰環(huán)腺苷酸(dBcAMP)能抑制對(duì)氧磷降低ABCA1表達(dá)和部分阻斷對(duì)氧磷降低膽固醇流出的作用。
4.AC激動(dòng)劑福斯高林(Forskolin)和PDE抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)能拮抗對(duì)氧磷
15、降低cAMP的作用。
結(jié)論:
對(duì)氧磷下調(diào)鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇堆積可能與干預(yù)cAMP信號(hào)通路有關(guān)。
第四章、對(duì)氧磷酶1基因轉(zhuǎn)染對(duì)對(duì)氧磷促巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響
目的:
觀察外源性PON1基因轉(zhuǎn)染對(duì)對(duì)氧磷促鼠源巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成的影響
方法:
1.實(shí)驗(yàn)分為以下各組:(1)PA
16、W巨噬細(xì)胞組、(2)Ox-LDL+RAW巨噬細(xì)胞組、(3)對(duì)氧磷+Ox-LDL+RAW巨噬細(xì)胞組、(4)對(duì)氧磷+Ox-LDL+PON1(+)RAW巨噬細(xì)胞組。將外源性的人的PON1基因轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,用Ox-LDL(50μg/ml)誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成,對(duì)氧磷處理組加對(duì)氧磷(100μmol/1)共孵育48 h。
2.油紅染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC及FC水平,計(jì)算CE水平,測(cè)定膽固醇流出率。
17、> 結(jié)果:
1.Ox-LDL+RAW細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平和CE/T值與RAW細(xì)胞組相比顯著性增高;對(duì)氧磷(100μmol/1)+Ox-LDL+RAW細(xì)胞組組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC較Ox-LDL+RAW細(xì)胞組均有顯著性增加,而PON1轉(zhuǎn)染拮抗了對(duì)氧磷的作用。
2.Ox-LDL+RAW組細(xì)胞膽固醇流出率與RAW細(xì)胞相比顯著性增加;與Ox-LDL+RAW細(xì)胞組相比,對(duì)氧磷(100μ
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