雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝的研究.pdf

1、氫化可的松(Hydrocortisone，HC)作為重要的腎上腺皮質(zhì)激素藥物和高檔甾體藥物的合成原料，這一特性一直以來都吸引著國內(nèi)外企業(yè)界和學(xué)術(shù)者的廣泛關(guān)注。應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)HC的菌種，國內(nèi)主要為藍(lán)色犁頭霉(Absidiacoerulea)，國外為新月彎孢霉(Curvularialunata)。二者在生產(chǎn)HC的過程中，各具特點(diǎn)。藍(lán)色犁頭霉對(duì)底物RSA(17α-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯)具有較高的脫乙?；钚院脱趸钚裕?/p>

2、但由于氧化專一性差，副產(chǎn)物量相對(duì)較高，產(chǎn)物的分離精制難。HC對(duì)RSA的收率僅為45％，對(duì)薯蕷皂素的總收率約為19％。新月彎孢霉氧化專一性較好，副產(chǎn)物量較少，但脫乙酰活性相對(duì)較弱，以RS(17α，21-二羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮)投料，收率可達(dá)55％-60％。本文以現(xiàn)行工業(yè)生產(chǎn)HC產(chǎn)率和底物投料方式為對(duì)照，采用藍(lán)色犁頭霉和新月彎孢霉為菌種，通過工藝方法和底物投料方式的改進(jìn)，尋找有效提高HC收得率和底物投料濃度的工藝途徑。
　

3、　 本文利用藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerulea AS3.65)和新月彎孢霉(Curvularia lunata AS3.4381)(=ATCC 12017=NRRL 2380)為出發(fā)菌株，通過自然選育的篩選方法，獲得相對(duì)高活性A.coerulea和C.lunata，傳代5-7代，4℃保存，備用。通過對(duì)兩菌搖瓶初、復(fù)篩過程的比較考察，二者發(fā)酵特性與前描述相符。為更好發(fā)揮二者各自的優(yōu)點(diǎn)，以協(xié)同轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，RSA(4％乙醇體系)為

4、投料底物體系，構(gòu)建兩菌分別培養(yǎng)順序轉(zhuǎn)化、兩菌分別培養(yǎng)同時(shí)轉(zhuǎn)化和兩菌混合培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化三種方案，得到較佳方案為順序轉(zhuǎn)化。通過對(duì)菌絲體投加時(shí)間、菌體量和投料負(fù)荷的考察，確定出最佳的轉(zhuǎn)化條件—兩菌二級(jí)接種均為5％(v/v)，磷酸緩沖液(pH6.0)包含底物的轉(zhuǎn)化介質(zhì)中，A.coerulea先行轉(zhuǎn)化20h時(shí)，添加C.lunata構(gòu)成協(xié)同轉(zhuǎn)化體系，并且此體系在首輪投料濃度分別為2g/L和1g/L時(shí)，能分別反復(fù)利用3和6輪。這較A.coerulea和C

5、.lunata單菌轉(zhuǎn)化，有效地抑制了14α-羥化副產(chǎn)物和其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在搖瓶實(shí)驗(yàn)的水平上，HC產(chǎn)率可高達(dá)81.6％(HPLC測得數(shù)據(jù))。
　　 為進(jìn)一步提高投料濃度，本文采用相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道常用于甾體轉(zhuǎn)化的有機(jī)溶劑為介質(zhì)，以單菌和協(xié)同菌絲體為生物催化劑，篩選到對(duì)生物穩(wěn)定性影響較弱的有機(jī)溶劑丙三醇。并通過添加表面活性劑吐溫80和對(duì)底物體系的前處理方式的考察，建立的Tween80/丙三醇/RSA(1.0/3.0/1.0，v/v/w)

6、底物添加體系使得投料濃度高達(dá)5g/L時(shí)，雙菌轉(zhuǎn)化體系在104h內(nèi)，仍能定量轉(zhuǎn)化底物，得到高產(chǎn)率的HC。且在以3g/L為初始投料的搖瓶放大實(shí)驗(yàn)中，協(xié)同轉(zhuǎn)化體可重復(fù)利用2-3輪，生成的目標(biāo)產(chǎn)物平均收率達(dá)52％。此投料方法較國內(nèi)現(xiàn)行業(yè)所使用投料方式下的產(chǎn)物收率45-47％高出7-5％?？梢姡⒌牡孜锾砑芋w系比較適合RSA制HC現(xiàn)有國內(nèi)產(chǎn)業(yè)體系的工藝改進(jìn)，可應(yīng)用性及技術(shù)集成度強(qiáng)，對(duì)提升我國甾體激素HC的生產(chǎn)技術(shù)水平很有參考價(jià)值。
　　

7、 另外，所建立的新型底物投料體系Tween80/丙三醇/RSA(1.0/4.0/1.0，v/v/w)被用于單菌C.lunata轉(zhuǎn)化時(shí)，C.lunata呈現(xiàn)出較強(qiáng)的脫乙?；钚?，且HC產(chǎn)率維持在較高水平。以2g/L進(jìn)行投料，5L發(fā)酵罐連續(xù)2輪和5L搖瓶放大的制備實(shí)驗(yàn)，平均收率達(dá)53.3％?？梢姡诤线m的投料介質(zhì)體系中，新月彎孢霉對(duì)底物RSA仍能表現(xiàn)出較佳的脫乙?；钚?。此途徑減少了RSA→RS的化學(xué)步驟，節(jié)能降耗且環(huán)保的特性賦予了其較強(qiáng)的工業(yè)