Development of Fluorescence Quantitative PCR method for Detection Dibutyl Phthalate.pdf

1、本課題研究目的旨在建立采用熒光定量PCR檢測鄰苯二甲酸二丁酯濃度的新方法。鄰苯二甲酸二丁酯可以活化雌激素受體使之與包含特定序列的雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合的DNA因受到保護可抵抗核酸外切酶ExoⅢ的消解而被保留，痕量的保留DNA可通過PCR擴增定量。根據(jù)該原理，首先從鯉魚肝臟細胞中提取含雌激素受體的細胞溶質(zhì)，再與不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯結(jié)合使雌激素受體活化，形成配體-受體復(fù)合物。然后，以雙鏈pUC19質(zhì)粒DNA作為模板，設(shè)計合成特異性引物序

2、列，通過普通PCR擴增制備雙鏈結(jié)合DNA，使雙鏈結(jié)合DNA與配體-受體復(fù)合物反應(yīng)結(jié)合后，用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶消解，去除未受到保護的DNA。利用消解后產(chǎn)物作為模板，進行熒光定量PCR擴增反應(yīng)，從而建立Ct值與鄰苯二甲酸二丁酯濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時探索最優(yōu)反應(yīng)條件，并確定熒光定量PCR的最低檢測限及其結(jié)果的重復(fù)性。將該方法用于檢測實際環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的含量，并將檢測結(jié)果同高效液相色譜法進行比較，比較兩種檢測方法的不同。<

3、br>　　 實驗結(jié)果表明，鄰苯二甲酸二丁酯濃度在10-5g/L至10-10g/L之間時，鄰苯二甲酸二丁酯濃度與Ct值線性關(guān)系顯著。當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯濃度為10-10g/L時，結(jié)果呈正相關(guān)性。在該方法中，鄰苯二甲酸二丁酯的檢測下限是8.439pg/L。將熒光定量PCR技術(shù)用于檢測水和土壤樣品中的鄰苯二甲酸二丁酯濃度，其檢測結(jié)果分別為0.1058μg/L和0.1357ug/g。
　　 同時在高效液相色譜法與熒光定量PCR方法檢測鄰